魯 鐵，圖力古爾

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)菌物研究所/教育部食藥用菌工程研究中心，長春 130118)

白蠟多年臥孔菌Perenniporia fraxinea(Bull.:Fr)Ryvarden隸屬于擔(dān)子菌門(Basidiomycetes)傘菌綱(Agaricomycetes)多孔菌目(Polyporales)多孔菌科 (Polyporaceae)多年臥孔菌屬 (Perenniporia)［1-2］。其子實(shí)體一般較大，1年生，菌蓋直徑8—16 cm，無菌柄，半背著生，木栓質(zhì)。菌蓋表面紅褐色或黃褐色，有寬的乳白色邊緣，表面平滑或有不規(guī)則的突起。子實(shí)層面白色至淺黃褐色，二系菌絲系統(tǒng)，生殖菌絲具鎖狀聯(lián)合，骨架菌絲具擬糊精和嗜藍(lán)反應(yīng)，擔(dān)孢子無色，卵型，厚壁，具嗜藍(lán)反應(yīng)，(5.2—6.1)×(4.6—5.2)μm［3］。生于白蠟樹、檫木、楊樹、柳樹等闊葉樹根基上，造成木材白色腐朽［4-5］，為闊葉樹心材腐爛病原菌之一［4，6-8］。有學(xué)者對(duì)其纖溶性蛋白酶進(jìn)行了研究［9］。該菌廣泛分布在溫帶和亞熱帶［10，11］，其在山東也較為常見［12］。

該菌具有抑制腫瘤的藥用功效［13-14］，在我國曾誤作“紅頰擬層孔菌 Fomitopsis cytisina(Berk.)Bondartsev＆Singer”［13］，有時(shí)，其形態(tài)上也常與槐生多年臥孔菌(俗稱槐耳)Perenniporia robiniophila(Murrill)Ryvarden混淆。

作者在對(duì)山東省大型真菌資源調(diào)查過程中，收集了山東省煙臺(tái)市煙臺(tái)山、昆崳山、招遠(yuǎn)市羅山等地的白蠟多年臥孔菌的菌株，并在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)成功的馴化栽培出子實(shí)體，本文記錄了栽培試驗(yàn)過程中的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為野生菌的生產(chǎn)和開發(fā)利用提供生態(tài)特性方面的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

生物學(xué)特性實(shí)驗(yàn)供試菌株采自山東煙臺(tái)市煙臺(tái)山，菌株編號(hào):20110816-02。

馴化栽培供試菌株:菌株編號(hào)和原菌采集地:20090720-03山東省招遠(yuǎn)市羅山、20100826-17山東煙臺(tái)昆崳山景區(qū)、20110816-02山東煙臺(tái)市煙臺(tái)山。全部菌株均由野生子實(shí)體組織分離所得，經(jīng)純化后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 培養(yǎng)基

(1)實(shí)驗(yàn)中不同溫度和pH值實(shí)驗(yàn)采用酵母膏蛋白胨培養(yǎng)基，每1000 mL:酵母浸膏20 g、葡萄糖20 g、蛋白胨 10 g、KH2PO41 g、MgSO40.5 g、瓊脂 20 g。

(2)不同碳氮源培養(yǎng)基配方

碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方:酵母膏 2 g、KH2PO42 g、MgSO41 g、瓊脂20 g。

氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方:葡萄糖 20 g、KH2PO42 g、MgSO41 g、瓊脂20 g。

(3)正交試驗(yàn)基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方:KH2PO42 g、MgSO41 g、瓊脂20 g。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 溫度試驗(yàn)

白蠟多年臥孔菌接種在PDA培養(yǎng)基的平板上，26℃培養(yǎng)，待其長滿培養(yǎng)皿時(shí)。用直徑1 cm的打孔器取菌絲塊一塊，接種于酵母膏蛋白胨培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿的中央。分別置于15、20、25、30、35℃的恒溫生物培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔24 h用劃線法測(cè)量菌落直徑。連續(xù)測(cè)量7 d。并觀察菌絲長勢(shì)。每個(gè)處理重復(fù)6次。

1.2.2 pH試驗(yàn)

用10%NaOH溶液和10%HCL溶液將酵母膏蛋白胨培養(yǎng)基的pH值調(diào)節(jié)至4、5、6、7、8等5個(gè)梯度。26℃培養(yǎng)，接種、培養(yǎng)、測(cè)量方法同1.2.1。每個(gè)處理重復(fù)6次。

1.2.3 碳源試驗(yàn)

碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基上分別加入:葡萄糖20 g，蔗糖20 g，麥芽糖20 g，可溶性淀粉20 g，乳糖20 g，果糖20 g。分別在6種碳源培養(yǎng)基平板上接種。接種、培養(yǎng)、測(cè)量方法同1.2.1。每個(gè)處理重復(fù)6次。

1.2.4 氮源試驗(yàn)

氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基上分別加入;酵母膏2 g，蛋白胨2 g，硫酸銨2 g，牛肉膏2 g，黃豆粉2 g，亞硝酸鈉2 g。分別在6種氮源培養(yǎng)基平板上接種。接種、培養(yǎng)、測(cè)量方法同1.2.1。每個(gè)處理重復(fù)6次。

1.2.5 正交試驗(yàn)

對(duì)以上4個(gè)因素碳源、氮源、溫度、pH值各選出3個(gè)水平，進(jìn)行四因素三水平的正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)基礎(chǔ)培養(yǎng)基上分別加上正交表上相應(yīng)的碳源、氮源、更改相應(yīng)的pH值，在相應(yīng)的溫度下進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.6 馴化栽培試驗(yàn)

對(duì)馴化栽培過程按二級(jí)種制作、栽培袋制作、發(fā)菌、催蕾、出菇期管理、采收進(jìn)行研究。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度

白蠟多年臥孔菌菌絲在15—35℃范圍內(nèi)均能生長，而且菌絲在15℃到35℃的溫度梯度下，菌絲生長長速呈現(xiàn)出極顯著差異。當(dāng)溫度為30℃時(shí)，菌絲生長速度最快，顏色較白，生長勢(shì)旺盛，因此綜合考慮認(rèn)為菌絲最適宜溫度是30℃，而超過這個(gè)溫度時(shí)菌絲生長受到抑制?？梢姕囟葘?duì)白蠟多年臥孔菌的菌絲生長影響較大(表1)。

表1 不同溫度對(duì)菌絲生長的影響Table1 Effecst of temperature on mycelial growth of Perenniporia fraxinea

2.2 pH值

白蠟多年臥孔菌在pH值4.0—8.0范圍內(nèi)都可以生長，而在pH值為5.0時(shí)，菌絲生長速度最快，長勢(shì)最好，菌絲濃密。pH值為4.0和6.0時(shí)菌絲長速差異不顯著，而pH值為7.0時(shí)菌絲生長勢(shì)明顯減弱，生長速度明顯變慢。pH值為4.0時(shí)菌絲長勢(shì)較弱(表2)。

表2 不同p H對(duì)菌絲生長的影響Table2 Effects of pH on mycelial growth of Perenniporia fraxinea

2.3 碳源

碳源主要是構(gòu)成細(xì)胞骨架和提供能源的物質(zhì)，除乳糖外，其余碳源對(duì)白蠟多年臥孔菌的菌絲長速影響不明顯，在乳糖培養(yǎng)基上，菌絲速度明顯減慢，菌絲長勢(shì)明顯減弱?？梢钥闯霭紫灦嗄昱P孔菌對(duì)碳源的需求的廣泛性，相對(duì)而言，從菌絲長勢(shì)和長速雙重分析，麥芽糖、可溶性淀粉、果糖是較好的可利用碳源(表3)。

表3 不同碳源對(duì)菌絲生長的影響Table3 Effect of carbon sources on mycelial growth of Perenniporia fraxinea

2.4 氮源

氮源是合成核酸、蛋白質(zhì)和酶類、含氮代謝產(chǎn)物的物質(zhì)。酵母膏較其他氮源明顯促進(jìn)菌絲生長，而亞硝酸鹽不能被利用，甚至可能對(duì)白蠟多年臥孔菌的生長有毒害作用。在蛋白胨、硫酸銨、牛肉膏、黃豆粉培養(yǎng)基上，菌絲長速差異極其不明顯，但是從菌絲長勢(shì)角度上可以看出，牛肉膏好于蛋白胨、硫酸銨、黃豆粉(表4)。

表4 不同氮源對(duì)菌絲生長的影響Table4 Effects of nitrogen sources on mycelial growth of Perenniporia fraxinea

2.5 正交試驗(yàn)

從以上溫度、pH值、碳源、氮源單因素實(shí)驗(yàn)中分別挑選出最佳的3個(gè)種類作為3個(gè)水平，組建四因素三水平的正交分析表，直觀分析可見，溫度的極差最大，即為7.0?？梢姕囟仁怯绊懓紫灦嗄昱P孔菌生長的最主要因素。其次是pH值，極差為2.2。碳源和氮源分別為2.0和1.1。從均值中綜合菌絲生長勢(shì)情況可以看出，碳源的X1好于X2和X3，所以選X1，氮源的X1也好于X2和X3，所以也選X1。溫度選X3，pH值選X2。所以分別為 X1、X1、X3、X2，即麥芽糖、酵母膏、30℃、pH 值 6(表 5)。

對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，溫度的F值最大，pH值其次，然后是碳源、氮源。所以四種因素的顯著性差異大小順序是:溫度＞pH值＞碳源＞氮源。這與直觀分析結(jié)果一致(表6)。

表5 菌絲生長的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果的直觀分析Table5 The results of direct-viewing analysis of mycelial growth

表6 菌絲生長的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果的方差分析Table6 The results of F-test of mycelial growth

2.6 馴化栽培過程

2.6.1 二級(jí)液體菌種制作

由于液體菌種有生長速度快、生長周期短、菌齡一致、接種后發(fā)菌點(diǎn)多等優(yōu)點(diǎn)，所以選用液體菌種。其配方:每1000 mL的培養(yǎng)基成分為葡萄糖20 g蛋白胨6 g酵母膏5 g MgSO41 g KH2PO42 g。

制作過程:取備用菌株，室溫放置24 h后，進(jìn)行活化培養(yǎng)，待長滿后，使用1 cm打孔器打下菌絲塊，接入液體培養(yǎng)基中，放入振蕩式搖床，培養(yǎng)溫度25℃、搖床轉(zhuǎn)速150 r/min，待培養(yǎng)6 d后使用。

2.6.2 栽培袋制作

配方:棉籽殼79%、麥麩20%、石灰粉1%，加水?dāng)嚢杌靹颉Ｈ缓髮⑴囵B(yǎng)料裝袋，使含水量在65%左右。［料水比約為1:(1.3—1.5)］。中間用徑粗1.5 cm的小棒扎一洞，以利通氣，促進(jìn)菌絲生長。制作菌袋規(guī)格:直徑10 cm，高14.5 cm。采用高壓濕熱滅菌法:121℃，2 h。待自然冷卻后于超凈工作臺(tái)上接種。每袋接種量5 mL。

2.6.3 發(fā)菌

發(fā)菌室使用前用二氯異氰尿酸鈉等氣霧劑進(jìn)行滅菌，防止青霉等雜菌污染。將接完種的菌袋放到70%酒精消毒過的培養(yǎng)架上，溫度控制在30℃左右進(jìn)行發(fā)菌。培養(yǎng)時(shí)須避光保存，注意溫度和氧氣的供給，空氣濕度65%以下為宜;培養(yǎng)溫度，初期7—10 d內(nèi)，溫度保持在27—30℃，利于菌絲迅速萌發(fā)、封面，減少污染機(jī)會(huì)，之后30—45 d，溫度保持在25℃左右(低于28℃)發(fā)菌，防止二次污染和注意通風(fēng)。

2.6.4 催蕾

菌絲長滿15 d以后可以將溫度降低至14—16℃，進(jìn)行低溫催蕾。此時(shí)可以解開菌袋，使菌袋口朝上放置，但注意保濕。需要散射光線刺激子實(shí)體的分化。

2.6.5 出菇期管理

此階段主要是空氣濕度、溫度及供氧和光照四因素的協(xié)同作用，要保持較高的空氣濕度和較低的CO2濃度。溫度應(yīng)保持在21—27℃，溫度過低會(huì)影響子實(shí)體正常生長分化，溫度過高則使子實(shí)體難以分化或品質(zhì)差;空氣濕度保持在80%—90%之間;通風(fēng)，每天至少保持1 h左右的通風(fēng)時(shí)間，并保證一定的散射光光照。

2.6.6 采收

待子實(shí)體由白色逐步變深，顏色轉(zhuǎn)為深紅褐色，菌蓋背面凸顯出白色的菌管，且子實(shí)體不再生長時(shí)即可采收。子實(shí)體形態(tài)和野生形態(tài)相同。

3 結(jié)論與討論

通過菌絲在碳源、氮源、溫度、pH值單因素實(shí)驗(yàn)的生長情況和正交試驗(yàn)，最終確定白蠟多年臥孔菌最佳生長條件是溫度30℃、pH值6、碳源是麥芽糖、氮源是酵母膏。菌絲最佳培養(yǎng)溫度30℃，需要通風(fēng)、避光。子實(shí)體的出菇需要14—16℃的低溫刺激。子實(shí)體出菇生長溫度21—27℃，空氣濕度80%—90%。需要一定的散射光光照。當(dāng)出現(xiàn)乳白色子實(shí)層時(shí)且子實(shí)體不在生長時(shí)可以進(jìn)行采收。

在對(duì)白蠟多年臥孔菌的馴化栽培實(shí)驗(yàn)過程中，同時(shí)也嘗試了使用覆土的栽培方式，最終也得到了子實(shí)體，但覆土材料、覆土的厚度都對(duì)子實(shí)體的形成影響較大。其中腐殖質(zhì)土較好，較利于出菇。這可能是因?yàn)橥寥乐形⑸锖勘容^豐富，對(duì)出菇有促進(jìn)作用。土壤對(duì)菌棒有一定的機(jī)械刺激也利于出菇。但是具體的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。覆土栽培方式較利于減少生產(chǎn)強(qiáng)度，但是具體的栽培過程還有待做進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)優(yōu)化。同時(shí)對(duì)其進(jìn)行測(cè)產(chǎn)，例如生物轉(zhuǎn)化率等指標(biāo)的測(cè)定。

本文在馴化栽培中對(duì)其采收期定為子實(shí)體成熟不再生長為基準(zhǔn)，如果以藥用價(jià)值作為考慮對(duì)象，需要對(duì)其各生長期的各項(xiàng)活性指標(biāo)做檢測(cè)，選取活性成分含量最高的時(shí)期為采收期。

白蠟多年臥孔菌作為一種藥用菌，以往的報(bào)道僅限于在分類、生態(tài)、資源調(diào)查等方面，生物學(xué)特性、栽培方式等還鮮見報(bào)道。本文對(duì)其生物學(xué)特性和馴化栽培方面進(jìn)行研究，為更好的利用該資源提供生態(tài)特性有關(guān)基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。白蠟多年臥孔菌后續(xù)研究可以在菌絲液體深層發(fā)酵、天然藥物化學(xué)成分及藥理學(xué)活性成分等方面進(jìn)行深入。

致謝:感謝魯東大學(xué)朱建軍老師和吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)李長田老師對(duì)本文寫作的幫助。

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