俞婷婷，張 煥，張 濤，單 莉，韓志剛

惡性腫瘤患者在治療前后均有較高的貧血發(fā)生率，既往研究認(rèn)為重組人促紅細(xì)胞生成素 (rH－EPO)治療腫瘤相關(guān)的貧血可以減少患者輸血、避免輸血感染、改善患者生活質(zhì)量;但近年研究發(fā)現(xiàn)，rH－EPO有可能直接或間接導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞生長而促進(jìn)疾病進(jìn)展，且與促紅細(xì)胞生成素 (EPO)的促血管生成作用有關(guān)［1］。EPO可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長發(fā)育，引起惡性腫瘤新生血管形成，而新生血管基底膜不完整，腫瘤細(xì)胞可通過，與成熟正常毛細(xì)血管相比，新生血管更易接受腫瘤細(xì)胞，從而成為腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移途徑［2］。本研究通過檢測非小細(xì)胞肺癌 (NSCLC)組織中EPO的表達(dá)，探討其與新生血管形成的關(guān)系，為臨床更好地應(yīng)用rH－EPO治療NSCLC相關(guān)的貧血提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院2010年1—9月收治的經(jīng)病理確診且術(shù)后病理蠟塊保存完好的NSCLC患者58例，術(shù)前均未接受過放療或化療;血紅蛋白、肝腎功能、心電圖檢查正常，無其他惡性腫瘤病史，無心腦血管疾病及其他肺部疾病。58例患者中男37例，女21例;年齡36～75歲，平均54.7歲;鱗癌26例，腺癌32例;pTNM分期 (2009 IASLC國際肺癌分期第7版):Ⅰ期16例，Ⅱ期18例，Ⅲ期24例;高分化8例，中分化31例，低分化19例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移31例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移27例。收集上述患者術(shù)后肺癌組織蠟塊作為觀察組，以距離癌組織邊緣5 cm以外的非腫瘤性肺組織作為癌旁對照組。

選擇新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院同期收治的經(jīng)病理確診且術(shù)后病理蠟塊保存完好的肺良性病變患者45例，其中男30例，女15例;年齡24～68歲，平均53.4歲;肺結(jié)核23例，壞死性上皮肉芽腫性炎10例，肺炎4例，支氣管擴(kuò)張2例，孤立性纖維腺瘤2例，肺大泡、血管畸形、硬化性血管瘤及支氣管肺隔離癥各1例;有吸煙史22例，無吸煙史23例。收集上述患者術(shù)后良性病變肺組織蠟塊作為良性病變對照組。

1.2 主要試劑 兔抗人EPO多克隆抗體 (H－162)購自美國Santa Cruz公司，兔抗人CD34單克隆抗體、兔抗人內(nèi)皮素多克隆抗體、兔抗人FVⅢ相關(guān)抗原多克隆抗體、鏈霉親和素－生物素復(fù)合物 (SABC)試劑盒和二氨基聯(lián)苯胺 (DAB)顯色試劑盒購自北京中杉生物技術(shù)有限公司。

1.3 免疫組織化學(xué) 所有蠟塊組織均經(jīng)甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm切片，連續(xù)4張，選取其中1張復(fù)核病理診斷。60℃恒溫箱烘烤20 min，脫蠟水化;3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，修復(fù)抗原;滴加一抗，4℃冰箱過夜;滴加二抗，沖洗后DAB染色;蘇木精復(fù)染、脫水、封片;以磷酸鹽緩沖液 (PBS緩沖液)代替一抗作為陰性對照，以試劑生產(chǎn)公司提供的切片作為陽性對照。

1.4 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 采用盲法，由2名病理科主治醫(yī)生分別于光鏡下觀察，遇有分歧則通過協(xié)商決定。(1)EPO:主要表達(dá)于胞質(zhì)，以胞質(zhì)和 (或)胞膜出現(xiàn)棕色顆粒為陽性表達(dá)，同時(shí)觀察5個(gè)低倍視野 (×200)，分別計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，以其中陽性細(xì)胞數(shù)＜5個(gè)為陰性，≥5個(gè)為陽性。(2)微血管密度 (MVD):在低倍鏡下 (×100)尋找整張切片中富含血管組織的“熱點(diǎn)區(qū)” (hot port)，即棕黃染色密度最高的區(qū)域;在高倍鏡下 (×400)計(jì)數(shù)其血管數(shù)目，采用weidner評價(jià)標(biāo)準(zhǔn):以CD34染色為棕黃色的內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇記為1條獨(dú)立的血管，不以是否形成明顯管腔、腔內(nèi)有無紅細(xì)胞存在為判斷標(biāo)準(zhǔn)。每張切片選擇3個(gè)高倍視野進(jìn)行觀察，計(jì)算MVD，取平均值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以 (±s)表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料采用χ2或校正χ2檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 EPO的表達(dá) 觀察組EPO主要表達(dá)于胞質(zhì)，呈顆粒狀，彌漫性分布 (見圖1A)，陽性表達(dá)率為63.8%(37/58);癌旁對照組EPO主要表達(dá)于胞質(zhì)，呈顆粒狀 (見圖1B)，陽性表達(dá)率為19.0%(11/58);良性病變對照組EPO多呈陰性著色，部分間質(zhì)細(xì)胞可見弱著色，陽性表達(dá)率為8.9%(4/45)。3組EPO陽性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (χ2=42.303，P=0.000)，其中觀察組高于癌旁對照組 (χ2=40.121，P=0.000)和良性病變對照組 (χ2=40.343，P=0.000)，而癌旁對照組與良性病變對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (χ2=0.846，P=0.150)。

2.2 EPO陽性表達(dá)與患者臨床特征的關(guān)系 不同性別、年齡、pTNM分期、病理類型、分化程度及是否吸煙、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC患者EPO表達(dá)陽性率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，見表1)。

2.3 MVD 3組CD34染色的微血管分布均勻，血管壁完整，形態(tài)較規(guī)整 (見圖2)。觀察組MVD為 (25.72±5.50)，癌旁對照組為 (12.43±3.38)，良性病變對照組為 (10.33±2.88)，3組MVD比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (F=219.14，P=0.000)，其中觀察組高于癌旁對照組 (q=24.30，P＜0.01)和良性病變對照組 (q=26.31，P＜0.01)，而癌旁對照組與良性病變對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (q=3.59，P=0.134)。

2.4 EPO表達(dá)與MVD的關(guān)系 觀察組中EPO陽性表達(dá)者M(jìn)VD為 (26.14±5.26)，大于EPO陰性表達(dá)者的 (15.97±8.29)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (t=5.34，P=0.001)。

圖1 EPO在非小細(xì)胞肺癌組織及癌旁組織的表達(dá) (免疫組織化學(xué)，×100)Figure1 Expression of EPO in NSCLC tissues and adjacent tissues

表1 EPO陽性表達(dá)與患者臨床特征的關(guān)系Table1 Relationship of positive expression of EPO and patients'characteristics

圖2 非小細(xì)胞肺癌組織及肺良性病變組織中的新生微血管情況(CD34染色，×100)Figure2 Newborn microvascular in NSCLC tissues and benign lesions tissues of lung

3 討論

近年來，隨著相關(guān)領(lǐng)域研究的不斷進(jìn)展，人們對EPO的認(rèn)識(shí)產(chǎn)生了一次革命性的飛躍。EPO是一種內(nèi)源性促血管生成因子［2－4］，其自分泌/旁分泌通路可以抑制腫瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤血管形成及增殖分化，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，從而加速腫瘤細(xì)胞生長。EPO與腫瘤細(xì)胞增殖、抑制凋亡過程及腫瘤細(xì)胞對放化療的敏感度有關(guān)，參與了腫瘤的生長、浸潤、轉(zhuǎn)移、耐藥等過程。

本研究采用免疫組織化學(xué)法檢測EPO在癌組織、癌旁組織及肺良性病變組織中的表達(dá)，分析其陽性表達(dá)與患者臨床特征間的關(guān)系;采用CD34染色以觀察癌組織、癌旁組織及肺良性病變組織MVD，進(jìn)而探討EPO表達(dá)與MVD間的關(guān)系，以期為NSCLC的臨床診斷和治療提供參考。本研究結(jié)果顯示，觀察組EPO陽性表達(dá)率高于癌旁對照組和良性病變對照組，EPO多表達(dá)于NSCLC癌細(xì)胞胞質(zhì)和 (或)胞膜，以陽性或強(qiáng)陽性表達(dá)為主，呈顆粒狀，彌漫性分布。提示EPO可能參與了NSCLC的發(fā)生過程，可將EPO的陽性表達(dá)作為NSCLC的輔助性診斷指標(biāo)。

通過分析EPO陽性表達(dá)與患者臨床特征間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，不同性別、年齡、pTNM分期、病理類型、分化程度及是否吸煙、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC患者EPO表達(dá)陽性率均無明顯差異，與Ribatti等［5］報(bào)道不一致，分析其原因可能與EPO在不同腫瘤中陽性表達(dá)有差異有關(guān)。EPO陽性表達(dá)可促進(jìn)腫瘤新生血管形成，本研究結(jié)果顯示，EPO表達(dá)陽性者M(jìn)VD明顯高于 EPO表達(dá)陰性者，與文獻(xiàn)報(bào)道一致［6－8］。因此，在NSCLC治療過程中應(yīng)用EPO治療腫瘤相關(guān)的貧血時(shí)要考慮患者的獲益及風(fēng)險(xiǎn)。

1 Zagzag D.Angiogenic growth factors in neural embryogenesis and neoplasia ［J］.Am J Pathol，1995，146(2):293－309.

2 Fontanini G，Licchi M，Vignati S，et al.Angiogenesis as a prognostic indicator of survival in non－small cell lung carcinoma:a prospective study［J］.J Natl Cancer Inst，1998，89(12):881－886.

3 Yoon D，Agarwal N，Prchal JT.Does erythropoietin promote tumor growth?［J］.Clin Cancer Res，2008，14(6):1920.

5 Ribatti D，Marzullo A，Nico B，et al.Erythropoietin as an angiogenic factor in gastric carcinoma［J］.Histopathology，2003，42(3):246－250.

4 周成芳，周弟彌.促紅細(xì)胞生成素對腦出血后大鼠血管內(nèi)皮生長因子的影響 ［J］.海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，17(11):1449－1451.

6 Doleschel D，Mundigl O，Wessner A，et al.Targeted near－infrared imaging of the erythropoietin receptor in human lung cancer xenografts［J］.J Nucl Med，2012，53(2):304－311.

7 韓志剛，俞婷婷，單利.促紅細(xì)胞生成素及其受體在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及其與微血管密度的相關(guān)性 ［J］.中華腫瘤雜志，2012，34(8):605－608.

8 Rades D，Setter C，Dahl O，et al.Prognostic impact of erythropoietin expression and erythropoietin receptor expression on locoregional control and survival of patients irradiated for stageⅡ/Ⅲ non－small－cell lung cancer［J］.Int J Radiat Oncol Biol Phys，2011，80(2):499－505.