詹慶才，詹祎捷，劉之熙，朱克永

（1.湖南省水稻研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410125；2.北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院，北京 100083）

PCR技術(shù)被廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)、食品科學(xué)、醫(yī)學(xué)等相關(guān)研究領(lǐng)域。作為PCR技術(shù)的主要試劑的Taq DNA聚合酶用量日益增多。而目前大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室主要依賴公司商品化的Taq DNA聚合酶。為了降低研究和開發(fā)成本，一些實(shí)驗(yàn)室利用不同的分離純化方法生產(chǎn)Taq DNA聚合酶[1-4]。湖南省水稻研究所生物技術(shù)室利用含Taq DNA聚合酶基因的p Taq表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli菌株，誘導(dǎo)表達(dá)耐熱Taq DNA聚合酶，然后提取純Taq DNA聚合酶，并用考馬斯亮藍(lán)法和PCR分析其純度、濃度和活性。該技術(shù)旨在制備Taq DNA聚合酶，降低分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)成本。

1 材料與方法

1.1 材 料

含Taq酶基因的載體p Taq由中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育研究所提供，氨芐青霉素（Amp）、溶菌酶、苯甲基磺酰氟（PMSF）、異丙基硫代-b-D-半乳糖苷（IPTG）、Taq DNA 聚合酶、DNA Marker等生物化學(xué)試劑購自鼎國生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 外源基因在大腸桿菌中的表達(dá) 取出菌種，將少許的冰凍菌種培養(yǎng)物在LB平板（含Amp100 mg/mL）上劃線，37℃培養(yǎng) 16～20 h。挑取單菌落接種到6 mL含100 mg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜；用1.25 mL過夜培養(yǎng)的菌種接種到250 mL的LB液體搖瓶中（Amp終濃度為100 mg/mL），37℃培養(yǎng)4.5 h；在總量1 000 mL的培養(yǎng)液中加入120 mg的IPTG誘導(dǎo)（終濃度為0.5 mmol/L）。培養(yǎng)液在37℃，繼續(xù)培養(yǎng)16～20 h。

1.2.2 重組Taq DNA聚合酶的提取 3 000 g離心20 min收集菌體，每1 000 mL菌液離心后加入60 mL（30 mL×2）溶液 A（50 mmol/L Tris-HCl pH值 8.0；50 mmol/L Dextrose （glucose）；1 mmol/L EDTA）中重懸；將收集菌體洗，7 000 g離心10 min重新收集菌體。菌體再懸在40 mL（20 mL×2）溶液A中，混勻。加入終濃度為4 mg/mL的lysozyme（Sigma），室溫（25℃）放置 15 min。加入 40 mL的溶液B（10 mmol/L Tris-HCl pH值 8.0；50 mmol/L KCl；1 mmol/L EDTA （pH 值 8.0）；1 mmol/L PMSF；0.5%Tween 20；0.5%NP-40），75℃水浴保溫1 h，期間要晃動(dòng)幾次。4℃，10 000 g離心20 min重新收集上清液。上清液中加入5%PE（I聚乙烯亞胺），使終濃度為0.15%（體積比），加入時(shí)用磁力攪拌器攪拌，慢慢地逐滴加入。室溫下繼續(xù)攪拌10 min。4℃，10 000 g離心15 min重新收集沉淀。用24 mL的含25 mmol/L KCl的溶液C（20 mmol/L Hepes pH 值 7.9；1 mmol/L EDTA（pH 值 8.0）；0.5 mmol/L PMSF；0.5%Tween 20；0.5%NP-40）再懸，并洗滌沉淀。4℃，7 000 g離心15 min，收集沉淀。用24 mL含150 mmol/L KCl的溶液C再懸沉淀。4℃，2 500 g離心10 min，收集上清液。測(cè)量收集上清液的體積，使收集的上清液最終KCl的濃度為50 mmol/L（通過加入2倍體積的不含KCl的溶液C）。此時(shí)即完成了上柱前樣品的準(zhǔn)備。

1.2.3 重組Taq DNA聚合酶的純化 稱取7 g Bio-Rex 70的干樹脂，放在小燒杯中，用雙蒸H2O洗，去掉漂浮的小顆粒，室溫溶脹2 h，期間換幾次雙蒸H2O。用含50 mmol/L KCl的溶液C預(yù)平衡，裝層析柱。裝好樹脂后再用6～10倍柱床體積的含50 mmol/L KCl的溶液C平衡柱子。檢查進(jìn)入柱子和流出柱子的溶液C的pH值不變，將樣品裝在平衡好的層析柱上。

層析柱用6倍體積（約60 mL）以上的含50 mmol/L KCl的溶液C再次平衡。樣品用含200 mmol/L KCl的溶液C洗脫。一般準(zhǔn)備50 mL洗脫液，以3 mL體積在試管中分部收集。將含Taq酶較集中的分部收集在一起，放在透析袋中。用500 mL溶液 D（20 mmol/L Hepes pH 值 7.9；100 mmol/L KCl；0.1 mmol/L EDTA；0.5 mmol/L PMSF；1 mmol/L DTT；50%glycerol），4℃透析 20 h 左右，期間換一次透析液。透析后得到約2～3 mL的酶液。從透析袋中取出酶液，立即與20 mL溶液D混合，儲(chǔ)存在－20℃以下，以保持酶的長(zhǎng)期穩(wěn)定性。

1.2.4 重組Taq DNA聚合酶的活性測(cè)定 PCR擴(kuò)增反應(yīng)檢查所純化的Taq DNA聚合酶的活力，以目前實(shí)驗(yàn)室所用的Taq DNA聚合酶商品酶為對(duì)照。PCR反應(yīng)在10μL的反應(yīng)體積中進(jìn)行，包含1 μmol引物，1 μL DNA 樣品（10 ng），0.5單位市售Taq DNA聚合酶或0.1μL自制的Taq DNA聚合酶，1μLlO倍PCR反應(yīng)液（100 mmol/L Tris-HC1，pH 值 8.3；15 mmol/L MgCl2，500 mmol/L KC1，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01%的明膠）。所用引物為：正向序列5’-TGCCCTGTTATTTTCTTCTCTC-3’；反向序列：5’-GGTGATCCTTTCCCATTTCA-3’。

擴(kuò)增反應(yīng)條件為：94℃變性4 min，然后是94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，進(jìn)行 35 個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7 min。反應(yīng)采用96孔PCR盤在PE公司9700型基因擴(kuò)增儀上進(jìn)行。擴(kuò)增產(chǎn)物在質(zhì)量濃度為4%的Nusieve 3∶1瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分離，溴化乙錠染色，紫外光下觀察拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組Taq DNA聚合酶分離純化的結(jié)果

用3 mL的離心管分部收集層析分離的Taq DNA聚合酶，在SDS-PAGE上電泳，以購買的Taq DNA聚合酶做對(duì)照。確定哪個(gè)部分含Taq DNA聚合酶和含量的多少，根據(jù)電泳結(jié)果判斷酶的制備是否成功。一般Taq DNA聚合酶在第3、4、5個(gè)分部中被洗脫下來。

2.2 重組Taq DNA聚合酶的活性

利用等量的分離純化的重組Taq DNA聚合酶與市售的Taq DNA聚合酶同時(shí)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果表明，自制重組Taq DNA聚合酶與市售重組DNA聚合酶有相似的活性，都可擴(kuò)增出目的DNA片段，等量自制重組Taq DNA聚合酶和市售產(chǎn)品擴(kuò)增出的DNA量相同（圖1），說明自制產(chǎn)品與市售產(chǎn)品有相似的比活性。

3 討論

重組DNA Taq DNA聚合酶的分離純化有硫酸銨沉淀法[1，5-6]、利用 Ni柱親和色譜法[2]、AKTA 蛋白純化系統(tǒng)[3]及凍溶法[4]等方法。研究利用Taq DNA聚合酶耐熱性強(qiáng)的特點(diǎn)，采用溶菌酶、NP40裂解細(xì)菌熱變性沉淀雜蛋白，Bio-Rex 70柱層析透析，克服了溶凍法、硫酸銨沉淀法不能充分除去雜蛋白，AKTA蛋白純化系統(tǒng)雖然能得到高質(zhì)量的產(chǎn)品，但成本較高。通過優(yōu)化分離純化條件，得到了高純度的重組Taq DNA聚合酶，且保持了很高的活性，制備的Taq DNA聚合酶完全能滿足分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的要求。

[1]肖朝文，杜 娟，李晚忱，等.Taq DNA聚合酶制備技術(shù)的優(yōu)化[J].四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，（22）：318-321.

[2]丁燕華，劉樹濤，齊慶遠(yuǎn)，等.Taq DNA聚合酶熱純化制備[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，（39）：10153-10155.

[3]劉欽松，劉孟剛，張叢叢，等.重組Taq DNA聚合酶的表達(dá)和純化鑒定[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2012，（5）：124-126.

[4]何 鋼，王義強(qiáng)，李 樊，等.大腸桿菌表達(dá)重組Taq DNA聚合酶的分離和純化[J].中南林學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，（5）：50-54.

[5]王云天，秦 川，楊 瑞，等.基因重組Taq DNA聚合酶的制備[J].新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，（24）：551-553.

[6]劉天磊，薛守斌，王 芳，等.大腸桿菌表達(dá)的Taq DNA聚合酶的純化[J].遺傳，2012，34（3）：371-378.