王 娟，高國(guó)賦，王 智 ，魏寶陽(yáng)

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.湖南省農(nóng)業(yè)信息與工程研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410125）

眾所周知，鋅是動(dòng)物生長(zhǎng)必需的微量元素，它參與動(dòng)物機(jī)體組成，以酶的活化因子參與體內(nèi)物質(zhì)代謝，維持機(jī)體正常的生理功能并作為調(diào)節(jié)因子影響細(xì)胞復(fù)制和分化。目前，國(guó)內(nèi)在飼料中使用的鐵、鋅等微量元素主要以硫酸亞鐵、硫酸鋅等無(wú)機(jī)形態(tài)添加，這種形態(tài)在應(yīng)用中出現(xiàn)了很多弊病，如動(dòng)物吸收率低，與飼料中其他營(yíng)養(yǎng)成分協(xié)同配伍性差，影響了鐵、鋅的吸收利用[1]。大量試驗(yàn)表明，有機(jī)態(tài)微量元素有容易被動(dòng)物吸收、利用性高等特點(diǎn)[2]。由于酵母菌安全且營(yíng)養(yǎng)豐富，因此成為人們用來(lái)研究微生物富集微量元素的主要載體之一。酵母菌雖然有一定的富鋅能力，但如果培養(yǎng)基中鋅的濃度過(guò)高則會(huì)對(duì)酵母菌產(chǎn)生毒性，抑制酵母菌的生長(zhǎng)[3-5]，因此研究不同濃度Zn2+對(duì)酵母細(xì)胞生長(zhǎng)的影響十分必要。試驗(yàn)研究了不同Zn2+濃度下酵母菌生物量與細(xì)胞形態(tài)的變化，旨在為酵母鋅的研究和開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株

啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）由湖南省植物保護(hù)研究所陳玉榮老師提供。

1.2 培養(yǎng)基

3%麩皮固體培養(yǎng)基：30 g麩皮加200 mL水，煮25min后，用4層紗布過(guò)濾，添加2%瓊脂，再加水配成1 000 mL溶液，用三角瓶分裝，每瓶100 mL，121℃滅菌20min，制備平板培養(yǎng)基和斜面培養(yǎng)基。

富鋅液體培養(yǎng)基：30 g麩皮加200 mL水，煮25min后，用4層紗布過(guò)濾，再加水配成1 000 mL溶液，三角瓶分裝（每瓶100 mL）滅菌后添加滅菌的 ZnSO4·7H2O，使 Zn2+濃度分別為 0.01、0.05、0.08、.01、0.40、0.80 mol/L。

1.3 酵母菌對(duì)Zn2+耐受力的測(cè)定

將沒(méi)有富鋅的啤酒酵母作為出發(fā)菌種，先接種1×104cfu的啤酒酵母于Zn2+濃度為0.01 mol/L的麩皮培養(yǎng)液中，28℃、150 r/min搖瓶培養(yǎng)2 d；再取菌液在不含鋅的麩皮固體培養(yǎng)基上劃線分離培養(yǎng)單菌落，28℃倒置培養(yǎng)，2 d后挑取長(zhǎng)勢(shì)較好的酵母菌落轉(zhuǎn)接于斜面培養(yǎng)基保存，將保存的斜面菌種轉(zhuǎn)接于更高的含Zn2+培養(yǎng)液中同條件下?lián)u瓶培養(yǎng)。循環(huán)上述過(guò)程，對(duì)菌種進(jìn)行富鋅能力的測(cè)定。

1.4 Zn2+對(duì)酵母生長(zhǎng)的影響

根據(jù)酵母菌對(duì)Zn2+耐受力的測(cè)定結(jié)果，以不同Zn2+濃度的富鋅培養(yǎng)基接種酵母菌，28℃、150 r/min搖瓶培養(yǎng)2 d。分別取不同Zn2+濃度的富鋅培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)后的酵母菌懸液制作臨時(shí)裝片，在顯微鏡100倍和400倍的條件下觀察酵母細(xì)胞形態(tài)并拍照。采用光密度法測(cè)量酵母菌的生物量，取菌液1 mL稀釋10倍后在590 nm處測(cè)吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌對(duì)Zn2+耐受力的測(cè)定

在不同Zn2+濃度下,酵母菌在麩皮培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速度和菌落形態(tài)差異比較明顯。在沒(méi)有加Zn2+時(shí)，酵母菌生長(zhǎng)迅速，酵母菌落呈乳白色，濕潤(rùn)，邊緣整齊；在Zn2+濃度為0.01 mol/L時(shí)，酵母菌生長(zhǎng)迅速，菌落形態(tài)沒(méi)有明顯變化，仍呈乳白色，濕潤(rùn)，邊緣整齊；Zn2+濃度為0.08 mol/L時(shí)，酵母菌生長(zhǎng)較為緩慢，菌落體積略有減小，菌落乳白色，邊緣整齊，易挑取；Zn2+濃度為0.40 mol/L時(shí)，酵母菌生長(zhǎng)緩慢，菌落數(shù)目少，部分菌落邊緣不整齊，顏色呈半透明，難以挑??；Zn2+濃度為0.80 mol/L時(shí)，酵母菌不生長(zhǎng)。通過(guò)酵母菌對(duì)鋅的耐受力的測(cè)定發(fā)現(xiàn)，酵母菌對(duì)鋅的耐受力較強(qiáng)，在對(duì)菌種進(jìn)行富鋅能力馴化過(guò)程中，培養(yǎng)液中Zn2+濃度提高到0.40 mol/L時(shí)，該酵母菌菌株仍然可以生長(zhǎng)，并能富集一定量的鋅，但當(dāng)Zn2+超過(guò)一定的濃度后，會(huì)對(duì)酵母的形態(tài)和生長(zhǎng)產(chǎn)生影響。因此，試驗(yàn)以0.01、0.05、0.08、0.10 mol/L的富鋅液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，觀察Zn2+對(duì)酵母菌生長(zhǎng)的影響。

圖1 不同Zn2+濃度對(duì)酵母菌生物量的影響

2.2 Zn2+對(duì)酵母生物量的影響

從圖1中可以看出，Zn2+對(duì)酵母的生物量有明顯的影響，低濃度（0～0.010 mol/L）Zn2+能促進(jìn)酵母的生長(zhǎng)，隨著 Zn2+的濃度（0.05～0.10 mol/L）的增加，對(duì)酵母的生長(zhǎng)有抑制作用。出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因可能是Zn2+在酵母的生命活動(dòng)中影響了相關(guān)酶的活性，Zn2+作為一些酶的激活劑，在適當(dāng)?shù)臈l件下可以促進(jìn)相關(guān)酶的活性，當(dāng)Zn2+的濃度增加到一定的程度時(shí)，影響了培養(yǎng)液的滲透壓，同時(shí)也對(duì)部分酶有抑制作用，從而影響了酵母的生物量。

從上述結(jié)果可以看出，用酵母來(lái)富集Zn2+生產(chǎn)酵母鋅的產(chǎn)品時(shí)，Zn2+的富集是有一定的上限的，應(yīng)控制培養(yǎng)基中Zn2+的濃度，讓酵母在不嚴(yán)重影響產(chǎn)量的條件下富集Zn2+，這對(duì)富鋅酵母的育種和生產(chǎn)有一定的指導(dǎo)意義。

2.3 Zn2+對(duì)酵母細(xì)胞形態(tài)的影響

圖2 不同Zn2+濃度對(duì)酵母細(xì)胞形態(tài)的影響

從圖2中可以看出，對(duì)照組中酵母細(xì)胞形態(tài)體積較大且形態(tài)多樣，多為出芽狀、鏈狀或橢圓形，此外還有少量細(xì)胞呈圓形；當(dāng)Zn2+濃度為0.01 mol/L時(shí)，細(xì)胞體積略有減小，細(xì)胞形態(tài)主要是圓形或是出芽狀，且圓形的細(xì)胞明顯增多；當(dāng)Zn2+濃度提高至0.08 mol/L時(shí)，細(xì)胞主要呈圓形；當(dāng)Zn2+濃度為0.1 mol/L時(shí)，極少數(shù)細(xì)胞形態(tài)正常，絕大部分酵母細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，部分細(xì)胞呈圓形且聚集成片，形成大塊的細(xì)胞碎片。Zn2+對(duì)酵母細(xì)胞形態(tài)的影響，主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：（1）隨著培養(yǎng)液中Zn2+濃度的升高，酵母細(xì)胞的體積逐漸變小，只能偶爾觀察到體積較大的細(xì)胞（圖2-1～圖2-4）。（2）隨著Zn2+濃度的升高，出芽狀的細(xì)胞逐漸減少，細(xì)胞多數(shù)呈圓形，當(dāng)Zn2+濃度達(dá)到某一值時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)形態(tài)不規(guī)則的細(xì)胞（圖2-1、圖2-5）。（3）隨著培養(yǎng)液中Zn2+濃度的升高，菌液中的細(xì)胞碎片增多，許多圓形的細(xì)胞聚集破碎形成細(xì)胞碎片（圖2-6）。

Zn2+對(duì)細(xì)胞形態(tài)影響產(chǎn)生的可能原因是，高濃度的Zn2+影響了酵母細(xì)胞細(xì)胞壁合成有關(guān)酶的活性，使酵母細(xì)胞細(xì)胞壁的合成受到抑制，從而導(dǎo)致酵母細(xì)胞形態(tài)的改變，即由橢球形變成圓球形，甚至有的細(xì)胞不完整，出現(xiàn)不規(guī)則的形態(tài)。

3 討論

鋅是與動(dòng)物體新陳代謝關(guān)系密切的重要微量金屬元素之一[6]，酵母菌具有良好的富鋅能力，因而有關(guān)酵母鋅的研究一直受到廣泛的關(guān)注。試驗(yàn)初步研究了Zn2+對(duì)酵母菌生物量以及細(xì)胞形態(tài)的影響，結(jié)果表明，低濃度的Zn2+能夠提高酵母菌的生物量，高濃度的Zn2+會(huì)降低酵母菌的生物量；隨著Zn2+濃度的升高，酵母細(xì)胞的體積會(huì)逐漸變小，出芽狀的細(xì)胞越來(lái)越少，圓球形的細(xì)胞增多，有的甚至是不規(guī)則的；此外，高濃度的Zn2+會(huì)使酵母細(xì)胞聚集破裂形成大塊的細(xì)胞碎片。

有關(guān)Zn2+對(duì)酵母菌生物量及細(xì)胞形態(tài)影響的機(jī)理未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。推測(cè)Zn2+可能影響了酵母菌細(xì)胞壁的合成和透性。前人研究表明，Zn2+在酵母細(xì)胞中富集的主要部位是細(xì)胞壁，Bray等[7]認(rèn)為，酵母細(xì)胞在富集金屬離子的過(guò)程中，細(xì)胞壁是吸收積累金屬離子的主要場(chǎng)所，細(xì)胞壁中蛋白質(zhì)-甘露聚糖組成的外層比幾丁質(zhì)-葡聚糖組成的內(nèi)層更重要，并發(fā)現(xiàn)與金屬離子結(jié)合是細(xì)胞壁主要成分的一個(gè)功能；張之申等[8]研究認(rèn)為，鋅是在少量蛋白質(zhì)參與下與酵母細(xì)胞壁多糖強(qiáng)烈絡(luò)合而形成的多糖-鋅-蛋白絡(luò)合物，這種觀點(diǎn)與鎘、銅等能大量絡(luò)合在細(xì)胞壁上一致；此外，薛冬樺等[9]報(bào)道藥用鋅酵母種的鋅大部分為有機(jī)鋅，51%的鋅結(jié)合在酵母的細(xì)胞壁上，45%的鋅在短肽、氨基酸和無(wú)機(jī)鹽中，其余分布在線粒體和微粒體上。Zn2+是酵母細(xì)胞細(xì)胞壁合成有關(guān)酶的激活劑和抑制劑，加入低濃度的Zn2+，能激活相關(guān)的酶，從而提高生物量；而高濃度的Zn2+影響了培養(yǎng)液的滲透壓，同時(shí)也對(duì)部分酶的活性有抑制作用，影響酵母細(xì)胞壁的合成，從而影響酵母的形態(tài)和生物量。細(xì)胞壁能夠穩(wěn)定細(xì)胞的形態(tài)，控制物質(zhì)運(yùn)輸，細(xì)胞壁骨架的改變會(huì)引起細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，細(xì)胞壁透性的嚴(yán)重改變可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞破碎，但Zn2+改變酵母細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和透性的機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

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