劉 穎 ，崔 看，陳良城，陳 錦，成 平 ，匡逢春 ，趙一夫 ，夏石頭

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南省植物激素與生長發(fā)育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙410128；2.湖南省農(nóng)業(yè)信息與工程研究所，湖南 長沙 410125）

RFC（replication factor C，復(fù)制因子 C）是一種首先從人類Hela細(xì)胞提取物中純化、由5個(gè)亞基組成的復(fù)合物，是猿病毒40（SV40）DNA體外復(fù)制的必需因子。人類復(fù)制因子C（human replication factor C，hRFC）也被稱為激活子1，在ATP存在的條件下將分生細(xì)胞核抗原（proliferating-cell nuclear antigen,PCNA） 和 DNA 多聚酶 δ（polδ） 或 ε（polε）裝配到附有引物的模板上，并在人類單鏈DNA結(jié)合蛋白（hSSB）存在條件下促使DNA鏈有效延伸。RFC的5個(gè)亞基，1個(gè)大亞基（RFC140/RFC1）和 4個(gè)小亞基（RFC37/RFC2，RFC36/RFC3，RFC40/RFC4和RFC38/RFC5），在所有真核生物中普遍存在[1-2]。

目前，已有研究表明RFC復(fù)合物與DNA復(fù)制、修復(fù)和細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)控制有關(guān)[3-5]，但RFC復(fù)合物各亞基的具體功能仍不清楚，在植物中尤其如此。夏石頭教授課題組在用EMS誘變篩選更多抗生物和非生物脅迫的突變體過程中，證實(shí)了突變體rfc3-1是一個(gè)由堿基G變?yōu)锳的點(diǎn)突變體[6-7]，該點(diǎn)突變導(dǎo)致了植株早花、果莢生長和種子發(fā)育的缺陷，這表明AtRFC3在擬南芥花器官發(fā)育中起著重要作用。以擬南芥突變體rfc3-1為材料，對(duì)其花器官和種子發(fā)育進(jìn)行了研究，以期揭示AtRFC3在擬南芥花器官和配子發(fā)育過程中的重要作用。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為擬南芥哥倫比亞（Col）生態(tài)型和擬南芥rfc3-1突變體。

1.2 方法

1.2.1 RFC3基因突變對(duì)植物生長和表型的影響按照夏石頭等[8]的方法，將rfc3-1突變體和野生型種子消毒、春化后播種在滅菌過的培養(yǎng)土上。待種子發(fā)芽，幼苗生長3 d后揭開培養(yǎng)盤蓋，約10 d后將幼苗移栽到新培養(yǎng)土中，然后在16 h光照（23℃）/8 h黑暗（21℃）培養(yǎng)室條件下繼續(xù)培養(yǎng)10周。在此過程中仔細(xì)觀察植物的生長和表型。

1.2.2 RFC3基因突變對(duì)花和種莢的影響 植株開花后，至少取rfc3-1突變體和野生型植株各30朵花進(jìn)行拍照，并測(cè)量花瓣的長度、寬度和花瓣的面積。待種子成熟后，分別采集rfc3-1突變體和野生型的種莢并計(jì)量種莢長度、種子數(shù)量和每個(gè)種莢中敗育種子數(shù)。以上試驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.2.3 互補(bǔ)植株花器官性狀檢測(cè) 前期研究通過電擊穿孔法將陽性克隆轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101菌株中，然后用花器官浸漬法[9]將其轉(zhuǎn)化到rfc3-1純合子植株中，通過Basta抗生素篩選得到遺傳互補(bǔ)轉(zhuǎn)化子植株。用于遺傳互補(bǔ)植株檢測(cè)的配對(duì)引物設(shè)計(jì)如 下 ：5’TTGACGCCATATGCGTTGAC3’ 和 5’TATGGTCCTCCCGGTACTCG 3’用于野生型基因RFC3序列的檢測(cè)；5’TTGACGCCATATGCGTTG AC 3’和 5’TATGGTCCTCCCGGTACTCA 3’用于突變基因rfc3-1序列的檢測(cè)。將驗(yàn)證后遺傳互補(bǔ)植株和野生型植株播種到營養(yǎng)土上，開花后觀測(cè)遺傳互補(bǔ)植株的花器官發(fā)育表型。

2 結(jié)果與分析

2.1 RFC3基因突變對(duì)擬南芥植株生長及開花時(shí)間的影響

在相同生長條件下，rfc3-1突變純合子植株移植21 d后開始開花，但野生型植株開花時(shí)間比突變體植株延遲1周。試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，rfc3-1突變純合子植株開花時(shí)有8～9片真葉，并且大多數(shù)突變體植株開始長第9片真葉。但野生型植株此時(shí)只有6～7片真葉，并且大多數(shù)野生型植株才開始長第8片或者第9片真葉（圖1）。這表明RFC3基因突變導(dǎo)致rfc3-1突變純合子植株開花時(shí)間比野生型植株開花時(shí)間提早1周。

2.2 RFC3基因突變對(duì)擬南芥花型的影響

RFC3基因突變導(dǎo)致植株早花，且rfc3-1突變純合子植株的花明顯比野生型植株的小。對(duì)rfc3-1突變純合子植株和野生型植株花瓣的長度、寬度和花瓣面積進(jìn)行觀測(cè)，結(jié)果如表1所示，rfc3-1突變體植株花瓣的長度比野生型植株減少15.72%，差異達(dá)到顯著水平；rfc3-1突變體植株花瓣的寬度比野生型植株減少44.35%，差異達(dá)到顯著水平；rfc3-1突變體植株的花瓣面積僅為野生型植株花瓣面積的53.67%，顯著小于野生型植株的花瓣面積。

表1 野生型植株和rfc3-1突變體純合子植株的花瓣性狀

2.3 RFC3基因突變對(duì)擬南芥種莢發(fā)育的影響

為觀測(cè)突變對(duì)rfc3-1植株的種子繁殖的影響，進(jìn)一步檢測(cè)了rfc3-1植株種莢長度、單個(gè)種莢中種子數(shù)量和敗育種子數(shù)量。試驗(yàn)結(jié)果顯示，在相同生長條件下，rfc3-1突變體植株種莢長度只有8.55±0.17 mm，比野生型植株種莢長度12.18±0.15 mm短29.8%，兩者的差異達(dá)到了顯著水平；野生型植株平均每個(gè)種莢有48.08±0.91個(gè)種子，其中敗育種子有0.07±0.03個(gè)，而rfc3-1突變體植株中，平均每個(gè)種莢只有21.62±1.01個(gè)種子，其中有敗育種子3.30±0.25個(gè)，野生型表型種子有18.32±0.76個(gè)。突變體植株的種子敗育率為15.26%，顯著高于野生型植株種子敗育率（0.14%）。這表明RFC3基因突變顯著影響基因的功能，并且導(dǎo)致種子發(fā)育異常。圖2中顯示了rfc3-1種莢中典型敗育的種子。

2.4 rfc3-1突變體遺傳互補(bǔ)驗(yàn)證

為進(jìn)一步證實(shí)突變體植株的花、種子和胚胎發(fā)育表型缺陷是由于RFC3基因的點(diǎn)突變引起的，克隆了RFC3基因組DNA全序列和啟動(dòng)子序列，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花器官浸漬法轉(zhuǎn)化到rfc3-1突變體純合子植株中。經(jīng)過兩輪的Basta抗生素篩選，獲得了35株rfc3-1的T1植株。并發(fā)現(xiàn)其中5株幼苗是rfc3-1突變體純合子植株的遺傳互補(bǔ)植株（rfc3-1/rfc3-1::RFC3）。另外，遺傳互補(bǔ)植株的后代T2植株也通過特異性引物PCR得到進(jìn)一步驗(yàn)證?；パa(bǔ)型植株的種莢和種子性狀與野生型植株的沒有顯著差別，和野生型植株類似，遺傳互補(bǔ)植株的種莢幾乎沒有敗育的種子，并且遺傳互補(bǔ)植株的花也與野生型植株的相似。綜上所述，RFC3基因組DNA全序列的遺傳轉(zhuǎn)化能完全互補(bǔ)突變體植株的表型，證實(shí)了rfc3-1植株花器官發(fā)育的缺陷表型是由于RFC3蛋白質(zhì)的功能部分缺失所引起的。圖3顯示的是經(jīng)PCR驗(yàn)證的2個(gè)典型遺傳互補(bǔ)植株。

3 討論與結(jié)論

rfc3-1突變純合子植株在相同的生長條件下，開花時(shí)間比野生型植株早約1個(gè)星期；其花瓣平均面積比野生型植株降低了44.35%；種子敗育比達(dá)15.26%，顯著高于野生型。這說明RFC3突變影響了該基因的功能并導(dǎo)致種子敗育。這與AtRFC復(fù)合物的大亞基突變導(dǎo)致rfc3-1突變體種子敗育的表型是一致的，rfc3-1種子的敗育可能是由胚胎發(fā)育異常所導(dǎo)致的。

RFC3在花器官發(fā)育過程中起著重要作用，在頂芽生長、開花初期階段，以及種子發(fā)育的整個(gè)階段，花粉和胚胎發(fā)育進(jìn)程中都有很高的表達(dá)量。通過電子熒光象形網(wǎng)站（http://bbc.botany.utoronto.ca/efp/cgi-bin/efpWeb.cgi）的電子熒光雜交，發(fā)現(xiàn)A－tRFC3在擬南芥花器官的每個(gè)部位都有表達(dá)，但在不同階段和花器的不同部位的表達(dá)水平不同。RFC3在莖尖、心皮、花粉和胚胎中高量表達(dá)，其中莖尖中的表達(dá)水平是最高的。此外，在干種子和吸脹24 h的種子，以及種莢發(fā)育的所有階段，RFC3都有表達(dá)。在雄雌配子發(fā)育階段，RFC3在柱頭和子房組織中表達(dá)量都很高，且在花粉和胚胎發(fā)育所有階段持續(xù)高水平表達(dá)。通過把野生型RFC3基因組DNA連同啟動(dòng)子序列轉(zhuǎn)化到rfc3-1純合子中可使其恢復(fù)野生型表型，說明花器官發(fā)育的缺陷是由于RFC3蛋白部分功能缺失造成的。AtRFC3在擬南芥花器官和配子發(fā)育過程中起著重要作用，但有關(guān)AtRFC3更詳細(xì)的生物學(xué)功能及其機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。

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