伍華琛，莊惠生

(1.上海交通大學(xué)a.環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院;b.環(huán)境監(jiān)測(cè)評(píng)價(jià)研究所，上海 200240)

隨著現(xiàn)代工業(yè)的迅速發(fā)展，環(huán)境中出現(xiàn)越來(lái)越多的有機(jī)微量污染物。其中醫(yī)藥品與個(gè)人護(hù)理品(PPCPs)因其種類(lèi)繁多，用量巨大近年來(lái)受到科學(xué)界和公眾廣泛關(guān)注。PPCPs包括抗生素、止痛劑、抗癌劑、抗抑郁藥以及麝香、化妝品、消毒劑等［1］。醫(yī)藥品經(jīng)人體或動(dòng)物攝入后，只有少部分發(fā)生代謝，大部分以原形最終通過(guò)尿液或糞便進(jìn)入污水中。PPCPS則伴隨沐浴、游泳等活動(dòng)進(jìn)入排污管后匯入生活污水。此外，一些不用和過(guò)期的藥物則通過(guò)廁所丟棄等方式最終也會(huì)匯入到城市生活污水中。市政生活污水是PPCPs最主要的匯集源。

水楊酸(SA)是醫(yī)藥工業(yè)原料，被廣泛用于化妝品中。SA經(jīng)過(guò)直接排放或城市污水處理廠處理后進(jìn)入環(huán)境及地表水，尤其是河流中已經(jīng)廣泛受到這類(lèi)物質(zhì)不同程度的污染。各種酚類(lèi)化合物在生物體內(nèi)可與由S-腺苷蛋氨酸提供的甲基結(jié)合，這個(gè)過(guò)程稱(chēng)為甲基化。

5-甲基水楊酸(5-MeSA)屬于SA的一種代謝產(chǎn)物。目前對(duì)SA和5-MeSA殘留的主要檢測(cè)方法主要有:光度法［2，3］、熒光法［4］、化學(xué)發(fā)光法［5，6］、毛細(xì)管電泳法、電化學(xué)法、高效液相色譜法［7］以及氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用［8］法等。但是這些方法均存在著樣品前處理復(fù)雜、耗時(shí)、成本高等問(wèn)題。因此建立一種能夠簡(jiǎn)單、快速、檢測(cè)通量大的5-MeSA酶聯(lián)免疫吸附免疫檢測(cè)方法具有重要意義。

建立測(cè)定小分子有機(jī)污染物免疫分析新方法的關(guān)鍵技術(shù)在于小分子污染物的免疫原及其抗體的制備［9］。本文通過(guò)活性酯與碳二亞胺聯(lián)合法(Scheme 1)或混合酸酐法(Scheme 2)將5-MeSA與牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)制得偶聯(lián)比分別為14.6和3.4的免疫原(簡(jiǎn)稱(chēng)1和2)。用1和2分別免疫雄性新西蘭大白兔得到兩種多克隆抗體(簡(jiǎn)稱(chēng)3和4)。用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)得3和4的抗體效價(jià)分別為1∶256 000與1∶128 000。用3建立了測(cè)定5-SA的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法。該方法的 IC50為 149.04 ng·mL-1，最低檢測(cè)限為 4.19 ng·mL-1;3與苯酚、對(duì)甲酚和鄰氨基四甲基苯酚的交叉反應(yīng)率＜0.1%。

Scheme 1

Scheme 2

該方法的建立，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)檢測(cè)市政污水中5-SA及其他水楊酸類(lèi)物質(zhì)提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

UV-2012 PC型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì);Mnitiskan Mk3型酶標(biāo)儀。

酶標(biāo)板，生工生物(上海)公司;5-MeSA，BSA和OVA，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司;磷酸鹽緩沖溶液(PBS，c=10 mmol·L-1，pH 7.4);碳酸鹽緩沖溶液(CBS，c=50 mmol·L-1，pH 9.6);辣根過(guò)氧化物-羊抗兔IgG偶合物(酶標(biāo)記二抗)，Solarbio;實(shí)驗(yàn)用水為超純水;其他試劑均為分析純;新西蘭大白兔，年齡3 m～4 m，體重2.0 kg～2.5 kg，上海交通大學(xué)農(nóng)生學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.2 制備

(1)1的制備

在錐形瓶中加入 5-MeSA 60.9 mg(0.4 mmol)和 DMF 400 μL，攪拌使其溶解;攪拌下滴加混合液(二環(huán)己基碳二亞胺64.8 mg+N-羥基丁二酰亞胺38.8 mg+DMF 200 μL～300 μL)，滴畢，于室溫反應(yīng)8 h;于4℃反應(yīng)過(guò)夜。離心(9000 r·min-1，15 min)分離得上清液。

在上清液(400 μL)中滴加 BSA 150 mg的PBS 液(10 mL，0.02 mol·L-1)，滴畢，冰浴冷卻下反應(yīng)4 h。裝入透析袋中于PBS中透析5 d;離心分出上清液即得全抗原1，分裝于離心管中于-20℃冷凍保存。

僅改變5-MeSA 的用量［30.4 mg(0.2 mmol)］，用類(lèi)似的方法制得1'。

(2)2的制備

在錐形瓶中加入5-MeSA 30.4 mg(0.2 mmol)和DMF 200 μL，攪拌使其溶解;加入正丁胺20 μL(0.2 mmol)和氯甲酸異丁酯 30 μL(0.2 mmol)，于4℃反應(yīng)1 h。將反應(yīng)液100 μL滴入BSA 75 mg的CBS(10 mL)溶液中，滴畢，于4℃反應(yīng)4 h。裝入透析袋中于PBS溶液中透析5 d;離心分離出上清液即得全抗原2，于-20℃冷凍保存。

用OVA 60 mg替代BSA 75 mg，用類(lèi)似的方法制得2'(包被原)。

1.3 3和4的制備

酶聯(lián)免疫檢測(cè)最關(guān)鍵的步驟是得到親合力高，特異性強(qiáng)的抗體。用免疫原免疫動(dòng)物后獲得的免疫血清為多克隆抗體。將1和2分別免疫新西蘭大白兔，第三次免疫后每隔15 d通過(guò)耳緣靜脈采血，離心后取上清液通過(guò)間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法測(cè)定抗體效價(jià)，待抗體效價(jià)達(dá)到試驗(yàn)要求，取兔子全血得上清以篩選出抑制率最好的抗血清抗體3和4。

1.4 偶聯(lián)比的計(jì)算

將5-MeSA，BSA，OVA，1和2'配成一定濃度的溶液，用紫外分光光度分別于295 nm，285 nm，280 nm，278 m和275 nm處測(cè)得摩爾吸光系數(shù)(ε)，計(jì)算偶聯(lián)比。

1.5 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法

將抗體稀釋至最佳使用濃度后，每孔加入50 μL。將5-MeSA用50%乙醇配制成系列濃度［c=(0.01，0.1，1，10，25，50，100，250，1 000)ng·m L-1］，每孔加入50 μL，每塊板做空白對(duì)照，然后按間接ELISA方法［9］操作。

分別用苯酚、對(duì)甲酚和鄰氨基四甲基苯酚代替5-MeSA繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別得到各自的半數(shù)抑制濃度 IC50，計(jì)算交叉反應(yīng)率［交叉反應(yīng)率/%=IC50(5-SA)/IC50(替代物)×100%］。

2 結(jié)果與討論

有效人工抗原的合成是建立小分子有機(jī)污染物免疫分析方法的前提和關(guān)鍵。由于5-MeSA本身就具有活性基團(tuán)羧基，可直接通過(guò)交聯(lián)劑與載體偶聯(lián)。含有羧基的半抗原與載體耦聯(lián)的方法比較多，具體有N-羥基丁二酰亞胺活性酯法、混合酸酐法、碳二亞酰法、烷基氯甲酸法等。其中以N-羥基丁二酰亞胺與碳二亞酰聯(lián)用和混合酸酐法最常用。本文利用這兩種方法合成多個(gè)免疫原1，1'，2和2'，并測(cè)定其偶聯(lián)比，利用具有不同偶聯(lián)比的免疫原進(jìn)行免疫。

2.1 免疫原和包被原的鑒定

本文利用不同的合成方法合成了多個(gè)免疫原，進(jìn)行紫外全波長(zhǎng)掃描并計(jì)算偶聯(lián)比。根據(jù)紫外全波長(zhǎng)掃描結(jié)果和偶聯(lián)比，選擇不同偶聯(lián)比的免疫原進(jìn)行免疫。

圖1為5-MeSA，BSA，OVA，1和2'的 UVVis譜圖。從圖1可見(jiàn)，半抗原5-MeSA在293 nm處有特征吸收峰，BSA和OVA在278 nm和279 nm處有最大吸收峰。與載體相比，1和2'的吸收曲線均發(fā)生了改變，說(shuō)明已經(jīng)有新的物質(zhì)生成［10］。1與2'的最大吸收峰均出現(xiàn)在279 nm。另外2和2'在300 nm后仍有較高的吸收值，說(shuō)明偶聯(lián)物發(fā)生了紫移。合成后的溶液體系已不是載體蛋白和半抗原的簡(jiǎn)單疊加，從而確證了完全抗原偶聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生。

圖1 5-MeSA，BSA，OVA，1和2'的UV-Vis譜圖Figure 1 UV-Vis spectra of 5-MeSA，BSA，OVA，1 and 2'

偶聯(lián)率是指人工抗原中半抗原與載體蛋白的摩爾分子比。它是影響人工抗原免疫效果的重要因素。但是對(duì)于最佳偶聯(lián)比卻一直沒(méi)有定論。過(guò)去曾經(jīng)認(rèn)為偶聯(lián)比越高越好，但實(shí)驗(yàn)表明，在載體上覆蓋過(guò)多的半抗原得到的效果不如預(yù)期。因?yàn)檩d體上覆蓋過(guò)多的半抗原時(shí)，可能不利于載體與淋巴細(xì)胞的結(jié)合，從而使免疫原無(wú)法引起免疫反應(yīng)。Schnieder等［11］均認(rèn)為最佳偶聯(lián)比為10～20。但也有一些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明偶聯(lián)比為1時(shí)也可產(chǎn)生特異性抗體。雖然低偶聯(lián)率的人工抗原引起的免疫反應(yīng)較慢，但可獲得高親和力的抗體。

本試驗(yàn)利用不同的投料比與合成方法共合成了三個(gè)免疫原(1，1'和2)和1一個(gè)包被原(2')。三個(gè)免疫原和一個(gè)包被原的蛋白質(zhì)濃度和偶聯(lián)比見(jiàn)表格1。為了驗(yàn)證使用具有不同的偶聯(lián)比的免疫原對(duì)產(chǎn)生抗體的影響，本試驗(yàn)選用樣一與樣四對(duì)新西蘭大白兔進(jìn)行免疫。

表1 抗原的濃度與偶聯(lián)比Table1 Artificial antigen concentration and coupling ratio

2.2 抗體的制備與間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法

本試驗(yàn)用間接 ELISA方法測(cè)得的樣一免疫的一號(hào)兔，取全血得到抗體效價(jià)為25.6×104，抗體濃度為18.02 mg·mL-1。樣四免疫的二號(hào)兔取全血，得到抗體效價(jià)為12.8×104，抗體濃度為20.97 mg·mL-1。

將標(biāo)準(zhǔn)5-MeSA溶液按間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法進(jìn)行測(cè)定。以抑制率I為縱坐標(biāo)，5-MeSA溶液濃度對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線［抑制率I=A/A0(A為樣品吸光度值，A0為空白對(duì)照吸光度值)］，結(jié)果見(jiàn)圖2。從圖2可知，R值接近50時(shí)對(duì)應(yīng)的5-SA濃度的對(duì)數(shù)為2.17，該值恰好位于標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性區(qū)間上，故該方法的半數(shù)抑制濃度為149.04 ng·mL-1。以抑制率為90%時(shí)的濃度作為最低檢測(cè)限，可得最低檢測(cè)限約為4.19 ng·mL-1。在(1～100)ng·g-1(mL)間，I=A/A0與lg(5-SA)有較好的線性關(guān)系系而且斜率也較大。該范圍內(nèi)的的線性回歸直線方程為y=-20.36x+91.23，R2=0.992，可作為方法的最適濃度范圍。

圖2 5-MeSA的標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 2 Standard curve of 5-MeSA

5-MeSA與類(lèi)似物的交叉反應(yīng)結(jié)果為:5-Me-SA為100%，其余均 ＜0.1%，表明5-MeSA與結(jié)構(gòu)類(lèi)似物無(wú)交叉反應(yīng)。

3 結(jié)論

通過(guò)混合酸酐法和活性酯法與碳二亞胺聯(lián)合法合成5-甲基水楊酸免疫原和包被原。結(jié)果表明，混合酸酐法合成的免疫原偶聯(lián)比較高。活性酯法與碳二亞胺聯(lián)合法合成的低偶聯(lián)比的免疫原也可用來(lái)制備抗體，但是混合酸酐法合成的偶聯(lián)比高的免疫原免疫動(dòng)物得到的抗體效價(jià)較高。這可能是由于暴露基團(tuán)較多，獲得了較高的免疫應(yīng)答。

ELISA法與傳統(tǒng)的動(dòng)物生物法及色譜方法相比較，更快速經(jīng)濟(jì)，可以滿足大批量樣品的快速篩查需要。本文利用效價(jià)為25.6×104抗體建立的ELISA方法中5-甲基水楊酸的濃度與吸光值具有較強(qiáng)的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù) R2＞0.9。分析5-甲基水楊酸最低檢測(cè)限為4.19 ng·mL-1，滿足國(guó)際規(guī)定的20 μg·g-1的安全限值測(cè)定要求。測(cè)定5-甲基水楊酸的最適范圍為(0～100)ng·mL-1。

本文為其他水楊酸類(lèi)物質(zhì)的免疫分析方法的建立提供了參考依據(jù)，擬用于市政污水中5-甲基水楊酸的檢測(cè)。

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