張 科 張 垅 李淑英 杜海軍 趙 瑩 張云茹 周 玲 曾 毅

(河北聯(lián)合大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 河北唐山 063000;①河北省辛集市第二醫(yī)院;②中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所腫瘤病毒室，傳染病預(yù)防控制國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室病毒性腫瘤組)

胃癌(gastric carcinoma，GC)的發(fā)生、發(fā)展與多種因素相關(guān)，如化學(xué)致癌物(包括吸煙、嗜酒及亞硝胺)、營養(yǎng)(包括維生素和微量元素)缺乏及微生物(包括細(xì)菌、真菌及病毒)感染等。有研究顯示:大約10%的胃癌與EB病毒(EPstein－Barr virus，EBV)有關(guān)[1]，BARF1是EBV編碼的BamH I A區(qū)域的早期裂解基因，是近年來確認(rèn)的EBV新的致癌基因，可促進(jìn)上皮細(xì)胞永生化和轉(zhuǎn)化等功能[2，3]。本項(xiàng)研究采用攜帶 BARF1基因的真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染人胃上皮細(xì)胞，探討B(tài)ARF1基因轉(zhuǎn)染對人胃上皮細(xì)胞Bcl－2表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 B95－8細(xì)胞、真核表達(dá)載體 PIRES2－EGFP/BARF1及GES－1細(xì)胞本室保存。RNA提取試劑盒、RT－PCR試劑盒、RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液、DMEM培養(yǎng)液、小牛血清、CCK－8試劑盒及2xPower Taq PCR Master Mix均購于北京百泰克生物公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)。B95－8細(xì)胞使用 RPMI1640，GES－1細(xì)胞使用DMEM，并在培養(yǎng)液中添加10%滅活的小牛血清、100U/mL青霉素和100U/mL鏈霉素。培養(yǎng)于37℃，5%CO2的溫箱中，每2～3天換1次液。

1.2.2 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染與克隆。用 lipofectamine2000介導(dǎo)，將PIRES2－EGFP空載體及攜帶目的基因BARF1的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染人胃上皮細(xì)胞GES－1(按試劑盒說明書操作)。用有限稀釋法進(jìn)行克隆，轉(zhuǎn)染后第3天將細(xì)胞消化分散，按每孔200個細(xì)胞接入48孔細(xì)胞培養(yǎng)板，用含有300μg/mL的G418培養(yǎng)液進(jìn)行篩選，每2～3天換1次液，長出抗性克隆后擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.2.3 轉(zhuǎn)染細(xì)胞鑒定BARF1基因的表達(dá)。將抗性克隆細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)后，提取細(xì)胞RNA，RT－PCR鑒定BARF1基因的表達(dá)，所用引物如表1。PCR產(chǎn)物在含0.01%Gold View(核酸染料)的1.5% 瓊脂糖凝膠上電泳檢測。電泳后在凝膠成像儀照相。

表1 本研究中使用的擴(kuò)增引物

1.2.4 免疫組化法檢測Bcl－2的表達(dá)狀況。取對數(shù)生長期細(xì)胞，經(jīng)0.25%胰酶消化，用含10%胎牛血清的DMEM制成單細(xì)胞懸液，做活細(xì)胞計數(shù)，使細(xì)胞濃度為1×104個細(xì)胞/mL。將細(xì)胞懸液加入6孔板中，每孔加入10片已滅菌的蓋玻片，待蓋玻片中細(xì)胞匯合度達(dá)70% ～80%，停止培養(yǎng)。用PBS洗3次;用4%多聚甲醛4℃固定;免疫組化法(按試劑盒說明書操作)檢測Bcl－2的表達(dá);Bcl－2定位于細(xì)胞漿，在染色標(biāo)本片上于細(xì)胞漿中見到均勻棕黃色顆粒分布判為陽性，陰性結(jié)果不顯色，經(jīng)蘇木精復(fù)染后，細(xì)胞核顯示復(fù)染的藍(lán)色。

2 結(jié)果

2.1 單克隆細(xì)胞的獲得 G418為新霉素類似物，可以殺死沒有其抗性的細(xì)胞，而我們構(gòu)建的BARFl真核表達(dá)載體和空載體PIRES2－EGFP均具有neo抗性，所以通過G418可以篩選出陽性克隆細(xì)胞。約2周后即可看到有G418抗性克隆出現(xiàn)，而載體沒有成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞均已死亡。每種轉(zhuǎn)染細(xì)胞分別挑出3個單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)。

2.2 轉(zhuǎn)染細(xì)胞鑒定BARF1基因的表達(dá) 從陽性克隆細(xì)胞(包括BARFl轉(zhuǎn)染的細(xì)胞和空載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞)里提出總RNA，逆轉(zhuǎn)錄，以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板PCR擴(kuò)增BARF1，擴(kuò)增長度為524 bp(圖1)。

圖1 真核質(zhì)粒雙酶切鑒定

2.3 Bcl－2表達(dá)結(jié)果 Bcl－2的表達(dá)定位在細(xì)胞漿，陽性表達(dá)在細(xì)胞漿可見到均勻棕黃色顆粒分布，陰性結(jié)果不顯色，經(jīng)蘇木精復(fù)染后，顯示復(fù)染的藍(lán)色。免疫組化染色結(jié)果顯示:GES－1、轉(zhuǎn)染了空載體的GES－1細(xì)胞均為檢測到Bcl－2的表達(dá)，而轉(zhuǎn)染BARF1基因組的細(xì)胞漿中都能見到棕褐色的陽性結(jié)果(如圖①、②、③)。

圖1 GES－1未轉(zhuǎn)染細(xì)胞bc1－2檢測結(jié)果

圖2 GES－1轉(zhuǎn)染空載體細(xì)胞Bc1－2檢測結(jié)果

圖3 GES－1轉(zhuǎn)染BARF1細(xì)胞Bc1－2檢測結(jié)果

3 討論

BARF1是近年來確認(rèn)的EBV新的致癌基因，其致癌作用日益受到關(guān)注。李友瓊等[4]將 BARF1基因轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞系SGC7910后，能夠全面增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的腫瘤原性。

本研究通過脂質(zhì)體介導(dǎo)，將攜帶BARF1基因的真核表達(dá)載體PIRES2－EGFP/BARF1轉(zhuǎn)染人胃上皮細(xì)胞GES－1，建立了穩(wěn)定表達(dá)BARF1基因的人胃上皮細(xì)胞GES－1/BARF1，為進(jìn)一步探討B(tài)ARF1基因在胃癌發(fā)生及發(fā)展中的作用奠定了基礎(chǔ)。

Bcl－2是目前已知抑制細(xì)胞凋亡最重要的一種基因，其編碼蛋白是抑制細(xì)胞程序化死亡的關(guān)鍵因子，Bcl－2的高表達(dá)能使細(xì)胞凋亡減少，存活細(xì)胞數(shù)量增多而誘使腫瘤發(fā)生。Ohfuji[5]等研究了bcl－2在伴有淋巴基質(zhì)的EBVaGC與不伴有淋巴基質(zhì)胃癌的表達(dá)，結(jié)果表明，在EBVaGC中bcl－2表達(dá)增加，凋亡信號減少;Kume等[6]對EBVaGC及EBVnGC進(jìn)行細(xì)胞凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)進(jìn)行對比研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)EBVaGC組表現(xiàn)為低凋亡和 bcl－2 高表達(dá)[7，8]，EBVaGC 中高 bcl－2 表達(dá)可能對腫瘤細(xì)胞的凋亡有保護(hù)作用。Sheng等[9]利用缺失突變的方法證實(shí)，EBV編碼的BARF1基因N－末端蛋白是細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化所必須的區(qū)域，并且BARF1基因具有活化抗凋亡基因bcl－2表達(dá)的能力。本項(xiàng)研究結(jié)果顯示:未轉(zhuǎn)染的GES－1細(xì)胞中不表達(dá)或低表達(dá)Bcl－2蛋白，而BARF1轉(zhuǎn)染的GES－1細(xì)胞中Bcl－2高表達(dá)。這些結(jié)果表明，BARF1與Bcl－2的相互協(xié)調(diào)對于惡性轉(zhuǎn)化的發(fā)生是至關(guān)重要的，該基因可促進(jìn)上皮細(xì)胞永生化和轉(zhuǎn)化，在EB病毒相關(guān)胃癌的發(fā)生、維持惡性細(xì)胞的腫瘤原性及抗調(diào)亡中均起重要作用。

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