田 青 季 昀 龐學(xué)燕 王洪榮

（揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚(yáng)州225009）

隨著人們生活水平的提高，牛奶已經(jīng)成為一種飲食中不可或缺的營(yíng)養(yǎng)豐富的食品。為消費(fèi)者提供安全優(yōu)質(zhì)的奶制品，首先要有安全優(yōu)質(zhì)的原料奶，但目前我國(guó)的原料奶中乳脂肪和乳蛋白含量普遍低于發(fā)達(dá)國(guó)家10%左右，而我國(guó)人均牛奶占有量?jī)H是世界平均水平的1/4［1］，因此，提高牛奶產(chǎn)量和改善乳品質(zhì)迫在眉睫。乳中90%以上的蛋白質(zhì)是在乳腺中由氨基酸從頭合成的，其中酪蛋白約占乳中粗蛋白質(zhì)總量的80%，它的組成成分（α－酪蛋白、β－酪蛋白、κ－酪蛋白、γ－酪蛋白）對(duì)乳品品質(zhì)有很大的影響。胰島素（INS）作為機(jī)體內(nèi)唯一降低血糖和唯一同時(shí)促進(jìn)糖原、脂肪、蛋白質(zhì)合成的激素，對(duì)于奶牛乳腺上皮細(xì)胞乳蛋白合成的作用也顯得異常重要。對(duì)于INS的研究前人已經(jīng)取得了一定的成果，但多以體內(nèi)研究為主。在調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)代謝方面，體內(nèi)研究表明，泌乳早期灌注INS可以增加牛奶產(chǎn)量、牛奶蛋白質(zhì)總量和酪蛋白含量，與生長(zhǎng)激素同時(shí)作用效果更好［2］，另外，同時(shí)補(bǔ)充乳蛋白合成前體物氨基酸時(shí)，INS可以顯著增加血流量，增加細(xì)胞對(duì)氨基酸的攝?。?－5］，進(jìn)而促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成；體外研究表明，INS可以和催乳素（PRL）、生長(zhǎng)激素一樣直接影響細(xì)胞的增殖和激素的分泌，且這種作用與濃度有關(guān)［6－7］。INS還可以促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)重分配，抑制蛋白質(zhì)的分解，因而有利于生長(zhǎng)，糖皮質(zhì)激素的存在可以促進(jìn)這種作用，生長(zhǎng)激素的促蛋白質(zhì)合成作用，必須有INS的存在才能表現(xiàn)出來(lái)［8－9］。在作用機(jī)理方面，就目前研究進(jìn)展來(lái)看，一是血流量調(diào)控，二是經(jīng)過(guò)磷脂酰肌醇－3－激酶－雷帕霉素靶蛋白（PI3K－mTOR）信號(hào)通路發(fā)揮作用［10］。由此可見(jiàn)，INS對(duì)哺乳動(dòng)物生長(zhǎng)、泌乳和乳蛋白的合成均具有一定作用，因此，闡明INS對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞乳蛋白合成的作用機(jī)理就顯得很有必要。

為了了解INS對(duì)奶牛乳蛋白合成的影響的作用機(jī)理，本研究以奶牛乳腺上皮細(xì)胞為模型，研究不同濃度INS對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞中αs1－酪蛋白（CSN1S1）基因、雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號(hào)通路及Janus激酶－信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子（JAKSTAT）信號(hào)通路中相關(guān)基因表達(dá)的影響，進(jìn)而得到INS使用的最佳濃度并闡明外源INS對(duì)乳蛋白合成的影響及其在奶牛乳腺上皮細(xì)胞中促進(jìn)乳蛋白基因表達(dá)的作用機(jī)理。研究結(jié)果對(duì)進(jìn)一步通過(guò)信號(hào)通路中關(guān)鍵控制點(diǎn)來(lái)調(diào)控乳蛋白基因表達(dá)及奶牛乳腺乳蛋白的合成的研究有一定的學(xué)術(shù)意義，同時(shí)為在生產(chǎn)中提高奶牛產(chǎn)奶量和改善乳品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試劑：INS、PRL、氫化可的松（HYD）（Sigma，美國(guó)）；DMEM/F12、雙抗、胎牛血清（FBS）、表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、胰島素－轉(zhuǎn)鐵蛋白－硒（ITS）、磷酸鹽緩沖液（PBS）、兩性霉素B（Gibco，美國(guó)）。

儀器：倒置熒光顯微鏡（Leica，德國(guó)）、二氧化碳 培 養(yǎng) 箱 （Thermo，美 國(guó)）、Image Quant Capture 3000凝膠成像系統(tǒng)（GE，美國(guó)）、Eppendorf Thermal Cycler PCR 儀（Eppendorf，德 國(guó)）、海 爾 DW－86L388－86℃超低溫冰箱（海爾集團(tuán)）、Eppendorf移液器（Eppendorf，德國(guó)）、LDZX－50KBS型立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）、DYCP－31C型瓊脂糖水平電泳儀（槽）（北京六一儀器廠）、SW－CJ－1D型單人雙面凈化工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）、DK－8B型電熱恒溫水槽（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、Eppendorf Centrifuge 5415R冷凍離心機(jī)（Eppendorf，德國(guó)）、NanoDrop ND－1000濃度測(cè)定儀（GE，美國(guó)）、ABI7500熒光定量PCR儀（Applied Biosystems，美國(guó)）。

奶牛乳腺組織：來(lái)源于揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)牧場(chǎng)健康的泌乳期的中國(guó)荷斯坦奶牛。

1.2 方法

1.2.1 奶牛乳腺細(xì)胞的原代培養(yǎng)

選擇健康的泌乳期奶牛，采用無(wú)菌操作方法［11］進(jìn)行活體采樣，即將奶牛乳房的毛剔去，75%的酒精清洗消毒后，用無(wú)菌的手術(shù)剪在乳房底部至乳頭連線的中部做一個(gè)2cm大的切口，切取5g左右的乳腺實(shí)質(zhì)組織，移入含F(xiàn)BS（10%）、青霉素（300IU/mL）、鏈 霉 素 （300IU/mL）的 DMEM/F12培養(yǎng)基中，置于冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室，用PBS（含100IU/mL青霉素、100IU/mL鏈霉素）清洗3遍，洗去乳汁和血污之后，去除脂肪和結(jié)締組織，采用酶消化法［12］處理余下的乳腺腺泡，將細(xì)胞接種到25cm2培養(yǎng)瓶，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞的純化與傳代

根據(jù)成纖維細(xì)胞與上皮細(xì)胞對(duì)胰蛋白酶耐受時(shí)間的不同及2種細(xì)胞貼壁速度的差異，采用胰蛋白酶差時(shí)消化法及差速貼壁分離法對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞進(jìn)行純化［12］。待細(xì)胞長(zhǎng)滿90%以后，用0.25%胰酶消化、傳代并凍存。對(duì)細(xì)胞中角蛋白－18進(jìn)行鑒定后，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)奶牛乳腺上皮細(xì)胞中CSN1S1基因及mTOR和JAK－STAT信號(hào)通路中相關(guān)基因表達(dá)量。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選用4代的細(xì)胞，于復(fù)蘇后等密度接種于6孔板，待細(xì)胞長(zhǎng)滿70%～80%時(shí)，先用無(wú)血清無(wú)激素含有雙抗和兩性霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基過(guò)渡16h以上，然后分別用含有0（對(duì)照組）、2.5、25.0、250.0、5 000.0ng/mL INS的生長(zhǎng)培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞24h，收獲細(xì)胞，提取RNA，測(cè)定濃度，制備實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)液，用于相關(guān)基因的檢測(cè)。各基因表達(dá)量用2－ΔΔCt值表示。

1.4 相關(guān)基因引物設(shè)計(jì)

以甘油醛－3－磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參基因，采用Primer 3軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物信息見(jiàn)表1。

表1 引物信息Table 1 Information of primers

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

所有原始數(shù)據(jù)先用Excel 2003進(jìn)行整理，用SAS 9.1中ANOVA進(jìn)行顯著性分析，Tukey法進(jìn)行多重比較，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)的最終結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié) 果

2.1 INS對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞CSN1S1基因表達(dá)量的影響

由表2可知，與0ng/mL組（對(duì)照）相比，添加INS能夠促進(jìn)奶牛乳腺上皮細(xì)胞CSN1S1基因的表達(dá)，各INS組CSN1S1基因表達(dá)量均高于0ng/mL組，其中25.0ng/mL INS作用效果最好，極顯著高于0ng/mL組（P＜0.01）。

2.2 INS對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞mTOR信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)量的影響

由表3可知，與0ng/mL組相比，添加2.5、25.0和250.0ng/mL INS顯 著 或 極 顯 著 提 高PKB基因表達(dá)量（P＜0.05或P＜0.01）；INS能提高S－PRLR基因表達(dá)量，其中25.0和250.0ng/mL組極顯著高于0ng/mL組（P＜0.01），5 000.0 ng/mL組顯著高于0ng/mL組（P＜0.05）；從mTOR基因表達(dá)量來(lái)看，2.5和25.0ng/mL組極顯著高于0ng/mL組（P＜0.01），250ng/mL組也高于0ng/mL組，但差異不顯著（P＞0.05），5 000.0 ng/mL組極顯著低于0ng/mL組（P＜0.01）；對(duì)于4E－BP1基因表達(dá)量而言，2.5和25.0ng/mL組極顯 著 高 于 0ng/mL 組 （P＜0.01），250.0 和5 000.0ng/mL組也高于0ng/mL組，但差異不顯著（P＞0.05），且隨著濃度的增加表達(dá)量呈下降趨勢(shì)。以上數(shù)據(jù)顯示，INS能夠通過(guò)mTOR信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)CSN1S1基因的表達(dá)，但是INS的濃度過(guò)大反而不利于這些基因的表達(dá)。

2.3 INS對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞JAK－STAT信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)量的影響

由表4可知，與0ng/mL組相比，INS可增加奶牛乳腺上皮細(xì)胞JAK－STAT信號(hào)通路中JAK2和STAT5 A基因表達(dá)量。對(duì)JAK2基因表達(dá)量而言，2.5ng/mL組顯著高于0ng/mL組（P＜0.05），25.0 和 250.0ng/mL組則極顯著高于0ng/mL組（P＜0.01），而5 000.0ng/mL組高于0ng/mL 組，但差異不顯著（P＞0.05）；對(duì)于STAT5A基因表達(dá)量而言，2.5、25.0和250.0ng/mL組均極顯著高于0ng/mL組（P＜0.01），而5 000.0ng/mL組低于0ng/mL組，但差異不顯著（P＞0.05）。

表2 INS對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞CSN1S1基因表達(dá)量的影響Table 2 Effects of INS on expression level of CSN1S1gene in bovine mammary epithelial cells

表3 INS對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞mTOR信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)量的影響Table 3 Effects of INS on expression levels of mTOR signal pathway related genes in bovine mammary epithelial cells

表4 INS對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞JAK－STAT信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)量的影響Table 4 Effects of INS on expression levels of JAK－STAT signal pathway related genes in bovine mammary epithelial cells

2.4 INS濃度與各基因表達(dá)量間的相關(guān)性分析

由表5、表6和表7可知，當(dāng)INS濃度在0～5 000.0ng/mL時(shí)，JAK2與S－PRLR 基因表達(dá)量間呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與CSN1S1（P＝0.061）和STAT5 A（P＝0.090）基因表達(dá)量間有呈顯著正相關(guān)的趨勢(shì)；S－PRLR與CSN1S1基因表達(dá)量間有呈顯著正相關(guān)的趨勢(shì)（P＝0.098）；STAT5 A與mTOR、4E－BP1基因表達(dá)量間呈顯著或極顯著正相關(guān)（P＜0.05或P＜0.01）；INS濃度與其他基因表達(dá)量間無(wú)顯著相關(guān)（P＞0.05）。

當(dāng)INS濃度在0～25.0ng/mL時(shí)，S－PRLR與CSN1S1基因表達(dá)量間、INS濃度與S－PRLR、CSN1S1基因表達(dá)量間及4E－BP1與STAT5 A基因表達(dá)量間呈顯著的正相關(guān)（P＜0.05）。

當(dāng)INS濃度在25.0～5 000.0ng/mL時(shí)，INS濃度與JAK2基因表達(dá)量間呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），與S－PRLR基因表達(dá)量間有呈負(fù)相關(guān)的趨勢(shì)（P＝0.073），4E－BP1與CSN1S1基因表達(dá)量間、PKB與mTOR基因表達(dá)量間呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。

表5 INS濃度（0～5 000.0ng/mL）與各基因表達(dá)量間的相關(guān)性分析Table 5 Correlative analysis of INS concentration（0to 5 000.0ng/mL）and gene expression levels

3 討 論

3.1 INS對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞mTOR信號(hào)通路的影響

mTOR是一種非典型的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，mTOR信號(hào)通路由于處于生長(zhǎng)調(diào)節(jié)的中心環(huán)節(jié)而倍受關(guān)注［14］。mTOR是細(xì)胞內(nèi)多種重要信號(hào)傳導(dǎo)通路的調(diào)控蛋白，調(diào)控著細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的翻譯起始、轉(zhuǎn)錄、蛋白合成及降解功能，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和凋亡等重要環(huán)節(jié)［15－19］。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，INS是通過(guò)磷脂酰肌醇－3－激酶－蛋白激酶B－雷帕霉素靶蛋白（PI3K－PKB－mTOR）信號(hào)通路［20－22］與其受體結(jié)合而激活PKB，活化的PKB可以直接磷酸化 mTOR［23］，而PKB能夠控制細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。INS還是一個(gè)重要的中間代謝的調(diào)節(jié)因子，它的作用具有雙向性，既可以通過(guò)激活mTOR下游的轉(zhuǎn)錄因子和通過(guò)真核細(xì)胞翻譯啟動(dòng)因子2（eIF2）的作用去除PKB的調(diào)節(jié)抑制作用而調(diào)控蛋白質(zhì)的合成，也可以通過(guò)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄機(jī)制的生物合成而促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成［24］。研究表明，泌乳激素單獨(dú)添加效果不明顯［25］，與氨基酸同時(shí)添加能進(jìn)一步增強(qiáng)乳蛋白的合成，營(yíng)養(yǎng)素和激素可以通過(guò)mTOR信號(hào)路徑來(lái)調(diào)控乳蛋白的合成和轉(zhuǎn)運(yùn)［26－29］。INS首先激活I(lǐng)NS亞基受體從而促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞泌乳的生物合成［30］，然后通過(guò)改變4E－BP1、轉(zhuǎn)譯抑制因子和核糖體蛋白p70S6激酶1（P70S6K1）的磷酸化狀態(tài)使mTOR信號(hào)、氨基酸供應(yīng)、細(xì)胞能量狀態(tài)和激素信號(hào)級(jí)聯(lián)融合而調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的合成，還可以通過(guò)增加乳腺血漿流速來(lái)起作用［27－28］。研究表明，在 HYD和PRL這2種激素同時(shí)存在的條件下，INS可以促進(jìn)乳蛋白相關(guān)基因的表達(dá)和乳蛋白的合成，在缺乏PRL的條件下，INS對(duì)乳蛋白相關(guān)基因的表達(dá)也起著很關(guān)鍵的作用［31－32］。

表6 INS濃度（0～25.0ng/mL）與各基因表達(dá)量間的相關(guān)性分析Table 6 Correlative analysis of INS concentration（0to 25.0ng/mL）and gene expression levels

本試驗(yàn)結(jié)果表明，與0ng/mL組相比，添加2.5、25.0 和 250.0ng/mL INS能 夠 顯 著 提 高PKB基因表達(dá)量；從mTOR基因表達(dá)量來(lái)看，2.5和25.0ng/mL組極顯著高于0ng/mL組，250.0ng/mL組也高于0ng/mL組，但差異不顯著，5 000.0ng/mL組極顯著低于0ng/mL組。這與前人的研究結(jié)果一致，也進(jìn)一步證實(shí)了INS是通過(guò)增加激素受體表達(dá)，增加mTOR信號(hào)通路中正向調(diào)節(jié)基因表達(dá)的，促進(jìn)CSN1S1基因表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)乳蛋白合成，但高濃度的INS（＞5 000.0ng/mL）反而對(duì)乳蛋白合成不利。本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)25.0和250.0ng/mL組S－PRLR基因表達(dá)量極顯著高于0ng/mL組，5 000.0ng/mL 組 則 顯 著 高 于0ng/mL組，這說(shuō)明INS不但對(duì)自身受體起作用，同時(shí)還能影響S－PRLR基因表達(dá)，進(jìn)而影響乳蛋白的合成。

P70S6K1和4E－BP1是mTOR的2個(gè)直接下游靶蛋白，都是細(xì)胞蛋白質(zhì)生物合成的關(guān)鍵因子。在細(xì)胞內(nèi)，4E－BP1被mTOR磷酸化后，降低了與真核翻譯起始因子4E（eIF4E）的親和力，使eIF4E形成更多的eIF4F復(fù)合物，啟動(dòng)胞內(nèi)mRNA的翻譯［33］。mTOR的活性被抑制，使4E－BP1磷酸化減少，使其與eIF4E的親和力增加，從而阻斷mRNA翻譯起始復(fù)合物的形成，進(jìn)而阻斷細(xì)胞的增殖［34］。有研究表明，INS能夠減少4E－BP1含量并增加磷酸化4E－BP1含量來(lái)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄［35－37］。本試驗(yàn)研究表明，對(duì)于mTOR下游4E－BP1基因表達(dá)量，2.5和 25.0ng/mL 組 極 顯 著 高 于 0ng/mL組，250.0和5 000.0ng/mL組也高于0ng/mL組，但差異不顯著，且隨著INS濃度的增加表達(dá)量呈下降趨勢(shì)。分析其原因，一方面可能是基因4E－BP1高的表達(dá)量為有更多的4E－BP1進(jìn)入磷酸化狀態(tài)奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)，另一方面可能是已經(jīng)有足夠的促進(jìn)CSN1S1基因表達(dá)的4E－BP1進(jìn)入到磷酸化狀態(tài)而將4E－BP1富余下來(lái)，可用于進(jìn)一步促進(jìn)乳蛋白相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)乳蛋白的合成，這與整體試驗(yàn)結(jié)果相吻合。

表7 INS濃度（25.0～5 000.0ng/mL）與各基因表達(dá)量間的相關(guān)性分析Table 7 Correlative analysis of INS concentration（25.0to 5 000.0ng/mL）and gene expression levels

INS不僅僅是乳蛋白基因表達(dá)所必需的，還在多個(gè)層面誘導(dǎo)奶牛乳腺上皮細(xì)胞乳蛋白合成。研究表明，乳蛋白基因的表達(dá)需要INS、PRL和HYD，在164個(gè)對(duì)INS敏感的基因中，其中18個(gè)隨著氨基酸的攝取和代謝在轉(zhuǎn)錄和后轉(zhuǎn)錄水平與乳蛋白的合成密切相關(guān)［38］。單獨(dú)添加INS能夠同時(shí)促進(jìn)乳蛋白和非乳蛋白的合成，但PRL單獨(dú)添加效果不明顯，二者同時(shí)添加則具有協(xié)同作用，能進(jìn)一步促進(jìn)乳蛋白的合成［39］。也有研究表明，在皮質(zhì)醇和PRL存在的情況下，INS在乳蛋白合成中有潛在作用，INS刺激了直接參與蛋白質(zhì)合成的28個(gè)基因的表達(dá)，其中包括4種酪蛋白基因［40］。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，與0ng/mL組相比，添加INS能夠促進(jìn)奶牛乳腺上皮細(xì)胞CSN1S1基因的表達(dá)，各INS組CSN1S1基因表達(dá)量均高于0ng/mL，其中25.0ng/mL INS作用效果最好，極顯著高于其他各組，這與前人研究結(jié)果一致。

3.2 INS對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞JAK－STAT信號(hào)通路的影響

JAK是一類非受體酪氨酸激酶家族，其中JAK2是哺乳動(dòng)物JAKs家族中已發(fā)現(xiàn)的4個(gè)成員之一［41］。STAT5A是在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的JAKs的7種STAT底物之一，它在乳腺細(xì)胞增殖、分化和泌乳方面起著主要作用［42］。

激素可以和細(xì)胞膜上的激素受體結(jié)合形成復(fù)合物，激活胞內(nèi)JAK2，使激素受體上的酪氨酸殘基磷酸化，2個(gè)STATs蛋白通過(guò)各自磷酸化的酪氨酸和對(duì)方的含Src同源區(qū)2（SH2）功能域結(jié)合，形成STATs二聚體進(jìn)入核內(nèi)從而激活基因的轉(zhuǎn)錄，此路徑稱為JAK－STAT信號(hào)通路［43］。有關(guān)激素與JAK－STAT信號(hào)通路的研究主要集中在一些疾病研究中，涉及到的激素主要有生長(zhǎng)激素、PRL、雌激素等，它們的作用都是通過(guò)此途徑來(lái)發(fā)揮的［44－45］，關(guān)于INS的研究并不多見(jiàn)。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，與0ng/mL組相比，INS可以顯著增加奶牛乳腺上皮細(xì)胞JAK－STAT信號(hào)通路中JAK2和STAT5 A基因表達(dá)量，其中2.5ng/mL組顯著增加了JAK2基因表達(dá)量，25.0和250.0ng/mL組則極顯著增加了JAK2基因表達(dá)量，而5 000.0ng/mL組則差異不顯著，但高于0ng/mL組；另 外，與 0ng/mL 組 相 比，2.5、25.0 和250.0ng/mL組極顯著增加了STAT5 A基因表達(dá)量，而5 000ng/mL組則差異不顯著，且低于0ng/mL組。這與前人研究結(jié)果一致，也進(jìn)一步證實(shí)了JAK－STAT信號(hào)通路在奶牛乳蛋白合成中的作用，說(shuō)明INS在調(diào)節(jié)mTOR信號(hào)通路的同時(shí)也調(diào)節(jié)著JAK－STAT信號(hào)通路，也是通過(guò)促進(jìn)JAKSTAT信號(hào)通路中正向調(diào)節(jié)基因的表達(dá)來(lái)促進(jìn)奶牛乳腺上皮細(xì)胞CSN1S1基因的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)奶牛乳腺乳蛋白的合成，但是高濃度的INS（＞5 000.0ng/mL）可能對(duì)奶牛乳腺乳蛋白的合成不利。

通過(guò)本試驗(yàn)的相關(guān)性分析表明，當(dāng)INS濃度在0～25.0ng/mL時(shí)，S－PRLR 與CSN1S1基因表達(dá)量、INS濃度與S－PRLR、CSN1S1基因表達(dá)量及4E－BP1與STAT5 A基因表達(dá)量間呈顯著正相關(guān)；當(dāng)INS濃度在25.0～5 000.0ng/mL時(shí)，INS濃度與JAK2基因表達(dá)量間呈顯著負(fù)相關(guān)，與S－PRLR基因表達(dá)量間呈負(fù)相關(guān)的趨勢(shì)，4E－BP1與CSN1S1基因表達(dá)量、PKB與mTOR、STAT5 A基因表達(dá)量間呈顯著正相關(guān)；當(dāng)INS濃度在0～5 000.0ng/mL時(shí)，INS濃度與各基因表達(dá)量不相關(guān)，JAK2與S－PRLR基因表達(dá)量間呈顯著正相關(guān)，與CSN1S1和STAT5 A基因表達(dá)量間有呈顯著正相關(guān)的趨勢(shì)；S－PRLR與CSN1S1基因表達(dá)量間有呈顯著正相關(guān)的趨勢(shì)；STAT5 A與mTOR、4E－BP1基因表達(dá)量間呈顯著和極顯著正相關(guān)，這一結(jié)果與前面的試驗(yàn)結(jié)果完全一致，也進(jìn)一步證實(shí)了0～25.0ng/mL的INS可以促進(jìn)信號(hào)通路中各正向調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，而INS濃度在25.0～5 000.0ng/mL時(shí)，INS的促基因表達(dá)作用逐漸減弱，甚至抑制2條主要信號(hào)通路中各基因的表達(dá)，進(jìn)而使CSN1S1基因表達(dá)量逐漸減少；這一結(jié)果也證實(shí)了INS主要是通過(guò)mTOR和JAK－STAT 2條信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)乳蛋白相關(guān)基因表達(dá)的，這可能進(jìn)一步影響乳蛋白的合成。

4 結(jié) 論

①INS可以促進(jìn)奶牛乳腺上皮細(xì)胞CSN1S1基因的表達(dá)。

②INS促進(jìn)乳蛋白合成的作用機(jī)理可能是通過(guò)同時(shí)作用于mTOR和JAK－STAT 2條信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)乳蛋白相關(guān)基因表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)乳蛋白合成的；另一方面，INS還可能通過(guò)影響PRL受體的作用而影響乳蛋白的合成。

③INS對(duì)乳蛋白合成的調(diào)控有一定的劑量依賴關(guān)系，低濃度時(shí)隨著INS濃度的增加呈正向調(diào)控的關(guān)系，總體看來(lái)，添加25.0ng/mL INS時(shí)作用效果最好，但高濃度（＞5 000.0ng/mL）的INS對(duì)奶牛乳腺乳蛋白的合成反而不利。

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