汪水平 王文娟 趙橋芳 龔秋瑜 徐基釗 張朝娟

（1.西南大學(xué)榮昌校區(qū)，重慶402460；2.西南大學(xué)重慶市牧草與草食家畜重點實驗室，重慶 400716）

隨著現(xiàn)代集約化和規(guī)模化養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，動物感染疾病的風(fēng)險大大增加。為預(yù)防疾病、促進生長及提高飼料利用率，大量抗生素作為飼料添加劑被普遍使用。長期、大量地使用抗生素類添加劑會導(dǎo)致細菌產(chǎn)生抗藥性，抑制機體免疫功能，引起動物內(nèi)外源雙重感染及在動物產(chǎn)品和環(huán)境中殘留等負面效應(yīng)，故尋找抗生素替代品已經(jīng)迫在眉睫。植物提取物以其天然性、多功能性和環(huán)保性，引起從業(yè)者的廣泛關(guān)注。小檗堿，又稱黃連素，屬于異喹啉類生物堿，主要存在于毛茛科植物黃連、蕓香科植物黃柏及小檗科植物小檗中［1－2］，常用其鹽酸鹽形式。小檗堿的生理功能具有多種生理功能，在治療腫瘤、糖尿病、心血管疾病、高血脂、炎癥、細菌和病毒感染、腦缺血性損傷、精神疾病、阿爾茨海默病及骨質(zhì)疏松等方面均具有藥理作用［3－4］?？梢?，小檗堿藥性獨特、來源豐富，是抗生素的潛在替代品。目前，對小檗堿的作用效果及作用機理的研究多集中在動物的病理模型和人的臨床治療上，而以畜禽為對象作為飼料添加劑的研究少見報道。基于此，本試驗給肉兔飼喂小檗堿添加量不同的飼糧，通過對飼糧干物質(zhì)（dry matter，DM）、有機物（organic matter，OM）、粗纖維（crude fiber，CF）和粗脂肪（ether extract，EE）等營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率、能氮平衡及肉兔盲腸內(nèi)環(huán)境參數(shù)的考察，評估小檗堿對肉兔消化代謝的影響，探討小檗堿的作用機理，為其在生產(chǎn)實踐中應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗用小檗堿為其鹽酸鹽形式（鹽酸小檗堿），購自四川省什邡市某藥物原料廠，提取自黃柏的根和皮，為黃色結(jié)晶性粉末，無臭，味極苦，純度≥97.0%。

1.2 基礎(chǔ)飼糧

基礎(chǔ)飼糧參考 NRC（1977）［5］和 de Blas等［6］推薦的生長兔飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)配制，其組成及營養(yǎng)水平見表1。所有飼料原料過1.5mm篩粉碎，按不同組別分別混勻，再采用冷制粒工藝制成直徑為4mm的顆粒料。

1.3 試驗設(shè)計

選用128只50日齡、體重相近的健康新西蘭兔作為試驗動物，公母各占1/2。采用單因子隨機區(qū)組試驗設(shè)計，將128只新西蘭兔隨機分為4組，1個對照組和3個試驗組，每組32個重復(fù)，每個重復(fù)1只。對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，3個試驗組分別飼喂在基礎(chǔ)飼糧中添加10、20及30mg/kg鹽酸小檗堿的試驗飼糧。預(yù)試期為7d，正試期為27d。試驗組肉兔在預(yù)試期內(nèi)由基礎(chǔ)飼糧逐漸過渡到試驗飼糧。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)）Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet（DM basis） %

1.4 飼養(yǎng)管理

試驗于2011年12月4日到2012年1月6日在重慶市榮昌縣西南大學(xué)榮昌校區(qū)“7＋5”肉兔養(yǎng)殖創(chuàng)業(yè)組進行。兔舍為2層雙列式，每籠飼養(yǎng)1只。試驗兔采用顆粒料飼喂，自由采食與飲水，日喂2次（07：00和18：00），每次投料少量多添，投料時間不少于2h。兔舍自然采光，自然通風(fēng)，日打掃衛(wèi)生1次，保持兔舍清潔衛(wèi)生。經(jīng)測定，試驗期兔舍內(nèi)溫度平均為8.34℃，相對濕度平均為92.73%，溫濕指數(shù)平均為47.46。試驗期間，按兔場規(guī)定進行防疫、驅(qū)蟲和消毒，并密切觀察試驗兔行為，發(fā)現(xiàn)異常立即處理。

1.5 樣品采集及預(yù)處理

1.5.1 飼料、糞、尿樣采集及預(yù)處理

隨機采集飼料樣品1 000g，65℃烘干，過1mm篩粉碎，常溫保存待測DM、OM、總能（gross energy，GE）、氮、CF及EE含量。正試期第10～15天利用漏尿集糞板收集試驗兔排出的全部糞便，隨排隨收，所收集到的糞便裝袋，立即于4℃保存。每日早晚飼喂試驗兔時將收集的鮮糞準(zhǔn)確稱重，混勻，取50%作為樣品，并按重量的10%加入25%（質(zhì)量濃度）酒石酸溶液，混勻，－20℃保存。連續(xù)收集6d后，將全部糞樣解凍后混勻，65℃烘干測定初水分，再過1mm篩粉碎，常溫保存待測DM、OM、GE、氮、CF及EE含量。在全收糞的同時，利用集尿漏斗收集試驗兔排出的全部尿液，隨排隨收。由于試驗兔排尿量較少，故不需取樣。隨時用10%（體積分?jǐn)?shù)）硫酸將收集到的尿液pH調(diào)整至低于2，記錄加酸量，立即于4℃保存。連續(xù)收集6d后，將全部尿液混勻，用4層紗布過濾，得濾液，測定體積，加入5mL濃硫酸和10mL甲苯，混勻，裝瓶，－20℃保存待測氮和GE含量。樣品中DM、OM、氮、CF及EE含量的測定分別按照GB/T 6435—2006、GB/T 6438—2007、GB/T 6432—1994、GB/T 6434—1994及 GB/T 6433—2006的方法進行，GE含量的測定采用氧彈燃燒法。

1.5.2 盲腸內(nèi)容物樣采集及預(yù)處理

在正試期結(jié)束的第2天，從每組中挑選16只接近各組平均體重的試驗兔，采用耳緣靜脈注射空氣法致死后，取出盲腸，收集全部盲腸內(nèi)容物，迅速混勻，立即測定pH與微生物總脫氫酶（microbial total dehydrogenase，MTD）活性。取5g左右樣品放入50mL離心管中，加入5倍生理鹽水，混勻，4℃下4 000r/min離心10min，得上清液。取5mL上清液，加入1mL 1%（體積分?jǐn)?shù)）硫酸溶液，混勻，－20℃保存待測氨氮（ammonia nitrogen，NH3－N）濃度。剩余內(nèi)容物裝袋，－20℃保存待測微生物蛋白質(zhì)（microbia crude protein，MCP）濃度。MTD活性［7］與 NH3－N 濃 度［8］均 采 用 比 色法測定，MCP濃度采用三氯乙酸沉淀法［9］測定。

1.6 計算方法

1.6.1 飼糧營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率

飼糧某營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率＝100×（飼糧進食量×飼糧中某營養(yǎng)物質(zhì)含量－日排糞量×糞便中某營養(yǎng)物質(zhì)含量）/（飼糧進食量×飼糧中某營養(yǎng)物質(zhì)含量）［10］。

1.6.2 能量平衡

消化能（digestible energy，DE）＝食入GE－糞GE；

代謝能（metabolizable energy，ME）＝DE－尿GE；

GE表觀消化率＝100×DE/食入GE；

GE利用率＝100×ME/食入GE；

DE利用率＝100×DE/ME［11］。

1.6.3 氮平衡

沉積氮＝食入氮－（糞氮＋尿氮）；

氮表觀消化率＝100×（食入氮－糞氮）/食入氮；

氮利用率＝100×沉積氮/食入氮；

消化氮利用率＝100×沉積氮/（食入氮－糞氮）［10］。

1.7 統(tǒng)計分析

采用Excel 2003軟件對數(shù)據(jù)進行基本處理，然后采用SPSS 11.5軟件中的GLM模塊進行方差分析和顯著性檢驗，多重比較用Duncan氏法進行，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗兔飼糧 DM、OM、CF和 EE表觀消化率

由表2可知，對于DM表觀消化率，對照組顯著低于10mg/kg組和30mg/kg組（P＜0.05），極顯著低于20mg/kg組（P＜0.01）；對于 OM 和CF表觀消化率，對照組顯著低于10mg/kg組（P＜0.05），極顯著低于20mg/kg組（P＜0.01）；對于EE表觀消化率，對照組顯著低于20mg/kg組（P＜0.05），極顯著低于30mg/kg組（P＜0.01）。

2.2 試驗兔能量平衡

由表3可知，對于食入GE，10mg/kg組顯著低于30mg/kg組（P＜0.05），極顯著低于對照組和20mg/kg組（P＜0.01）；對于糞 GE，10mg/kg組極顯著低于其余3組（P＜0.01）；對于尿GE，對照組和30mg/kg組均極顯著高于10mg/kg組和20mg/kg組（P＜0.01），而10mg/kg組極顯著高于20mg/kg組 （P＜0.01）；對 于 DE 和 ME，20mg/kg組極顯著高于其余3組（P＜0.01），對照組和30mg/kg組極顯著高于10mg/kg組（P＜0.01）；對于GE表觀消化率，對照組顯著低于10mg/kg組和30mg/kg組（P＜0.05），極顯著低于20mg/kg組 （P＜0.01）；對 于 GE 利 用 率，20mg/kg組極顯著高于其余3組（P＜0.01）；對于DE利用率，20mg/kg組顯著高于對照組和30mg/kg組（P＜0.05）。

2.3 試驗兔氮平衡

由表4可知，對于食入氮，10mg/kg組極顯著低于其余3組（P＜0.01）；對于糞氮，10mg/kg組和20mg/kg組均極顯著低于對照組和30mg/kg組（P＜0.01），而30mg/kg組顯著低于對照組（P＜0.05）；對于尿氮，10mg/kg組顯著低于對照組和 20mg/kg組 （P＜0.05）；對 于 沉 積 氮，20mg/kg組顯著高于對照組和10mg/kg組（P＜0.05）；對于氮表觀消化率，對照組極顯著低于10mg/kg組 和 20mg/kg 組 （P ＜0.01），而30mg/kg組分別顯著（P＜0.05）和極顯著（P＜0.01）低于10mg/kg組和20mg/kg組；對于氮利用率，10mg/kg組和20mg/kg組均極顯著高于對照組和30mg/kg組（P＜0.01），而30mg/kg組顯著高于對照組（P＜0.05）；對于消化氮利用率，對照組顯著低于20mg/kg組和30mg/kg組（P＜0.05），極顯著低于10mg/kg組（P＜0.01）。

表2 試驗兔飼糧DM、OM、CF和EE的表觀消化率Table 2 Apparent digestibility of DM，OM，CF and EE in diets for experimental rabbits %

表3 試驗兔能量平衡Table 3 Energy balance of experimental rabbits

表4 試驗兔氮平衡Table 4 Nitrogen balance of experimental rabbits

2.4 試驗兔盲腸內(nèi)環(huán)境參數(shù)

由表5可知，對于pH，4組間差異不顯著（P＞0.05）；對于 MTD活性，對照組和30mg/kg組均極顯著低于10mg/kg組和20mg/kg組（P＜0.01）；對于 NH3－N 濃度，對照組和30mg/kg組均極顯著高于10mg/kg組和20mg/kg組（P＜0.01）；對于 MCP濃度，對照組顯著低于10mg/kg組 和 20mg/kg 組 （P＜0.05），極 顯 著 低 于20mg/kg組（P＜0.01），而20mg/kg組顯著高于10mg/kg組和30mg/kg組（P＜0.05）。

表5 試驗兔盲腸內(nèi)環(huán)境參數(shù)Table 5 Internal environment parameters of cecum of experimental rabbits

3 討 論

3.1 小檗堿對肉兔營養(yǎng)物質(zhì)利用效率的影響

DM和OM表觀消化率是動物對飼料消化特性的綜合反映，在一定程度上可表明消化道對飼料營養(yǎng)物質(zhì)的消化程度與利用效率。本試驗中，飼糧添加小檗堿可提高試驗兔DM和OM表觀消化率，表明小檗堿會影響肉兔消化生理、消化道結(jié)構(gòu)及機能，改善肉兔的消化力。CF是植物細胞壁的主要組成成分，包括纖維素、半纖維素、木質(zhì)素及角質(zhì)等成分［10］。肉兔借助盲腸和大腸微生物的發(fā)酵作用，可利用部分纖維素和半纖維素產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸，給機體提供能量［10］。本試驗結(jié)果表明，小檗堿可改善肉兔對飼糧纖維物質(zhì)的利用效率。由于植物源飼料原料所含脂肪很難提取，造成草食動物飼糧脂肪進食量被低估，特別是當(dāng)飼糧脂肪含量較低時，進入十二指腸的脂肪量比進食量要高，故采用進食量和糞中排泄量的差值來評定脂肪消化率通常會低估飼糧脂肪的消化率［11］。本試驗中，隨著飼糧小檗堿添加量的提高，試驗兔EE表觀消化率逐漸升高，表明小檗堿可改善肉兔對飼糧中脂肪的消化吸收。飼糧中的有機物質(zhì)，特別是蛋白質(zhì)、碳水化合物及脂肪這三大養(yǎng)分都是能量之源，在有機營養(yǎng)物質(zhì)代謝的同時必然伴隨著能量代謝。本試驗中，飼糧添加10、20及30mg/kg鹽酸小檗堿均可顯著或極顯著提高試驗兔的GE表觀消化率，而添加20mg/kg鹽酸小檗堿還可分別顯著和極顯著提高試驗兔的DE利用率和GE利用率，表明小檗堿可改善飼糧有機營養(yǎng)物質(zhì)在肉兔體內(nèi)的代謝狀況，提高飼糧的能量效率。飼糧添加小檗堿對肉兔氮平衡影響很大。與對照組相比，添加10和20mg/kg鹽酸小檗堿可顯著或極顯著提高試驗兔氮的表觀消化率、氮利用率及消化氮利用率，而添加30mg/kg鹽酸小檗堿可顯著提高試驗兔的氮利用率和消化氮利用率，表明小檗堿可改善肉兔氮代謝狀況，提高氮的生物學(xué)價值和利用效率。

同時，本試驗還發(fā)現(xiàn)，隨著小檗堿添加量的提高，試驗兔對飼糧DM、OM、CF、GE及氮的表觀消化率表現(xiàn)出先升后降的趨勢，顯示小檗堿對肉兔營養(yǎng)物質(zhì)利用效率的影響存在劑量效應(yīng)，其原因可能是：第一，小檗堿對腸道常駐有益菌抑制作用較弱，而對有害菌抑制作用較強，這有利于腸道內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定［12－13］；第二，小檗堿對平滑肌具有雙重調(diào)節(jié)作用，低濃度時對平滑肌具有興奮作用，而高濃度時會抑制平滑肌運動［14－15］；第三，小檗堿對胰腺消化酶的分泌作用呈劑量效應(yīng)關(guān)系，低濃度可刺激胰酶分泌，高濃度則起抑制作用［16－17］。劉嶺等［18］在斷奶仔豬飼糧中添加100mg/kg土霉素及200、500、1 000mg/kg三顆針提取物（相當(dāng)于含小檗堿39.6、99.0和198.0mg/kg），結(jié)果表明，適量（500mg/kg）添加三棵針提取物可提高仔豬對飼糧營養(yǎng)物質(zhì)的表觀消化率，而添加量過低或過高時改善效果并不理想。王志祥等［19］與丁景華等［20］在1日齡艾維茵肉仔雞基礎(chǔ)飼糧中添加5mg/kg阿維拉霉素及0.5、2.0、3.5、5.0g/kg三顆針提取物（相當(dāng)于含小檗堿99、396、693、990mg/kg），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加2.0g/kg三顆針提取物可極顯著提高十二指腸食糜中淀粉酶活性，而添加3.5和5.0g/kg三顆針提取物則會極顯著降低飼糧粗蛋白質(zhì)表觀代謝率和十二指腸食糜中淀粉酶的活性。本試驗結(jié)果與上述研究有相近之處。

3.2 小檗堿對肉兔盲腸內(nèi)環(huán)境參數(shù)的影響

盲腸內(nèi)容物pH系評價盲腸發(fā)酵狀況的基本指標(biāo)，受飼糧性質(zhì)及盲腸內(nèi)有機酸的生成、吸收與排出的綜合影響，決定著盲腸微生物對底物的發(fā)酵利用效率，而引起盲腸內(nèi)容物pH波動的根本原因是飼糧結(jié)構(gòu)與營養(yǎng)水平［21］。本試驗中，由于基礎(chǔ)飼糧相同，故肉兔盲腸內(nèi)容物pH基本不受小檗堿添加量的影響。MTD活性既可反映微生物發(fā)酵時脫氫酶傳遞氫的能力，又可反映微生物活性的高低。微生物內(nèi)有各種各樣的酶，其中參與生物氧化的重要酶有氧化酶和脫氫酶2大類，而以脫氫酶尤為重要［22］。脫氫酶把代謝產(chǎn)生的氫原子活化并傳遞給特定的受氫體，從而完成微生物的生物氧化過程中關(guān)鍵的一步［23］。MTD活性的提高意味著微生物發(fā)酵時氫傳遞加快，微生物活動能力增強［24］。本試驗結(jié)果表明，飼糧添加10和20mg/kg鹽酸小檗堿可提高肉兔盲腸內(nèi)有益微生物的活性。NH3－N是盲腸內(nèi)蛋白質(zhì)和內(nèi)、外源尿素分解的終產(chǎn)物，也是微生物合成蛋白質(zhì)的原料，其在盲腸內(nèi)的濃度受飼糧蛋白質(zhì)降解度、盲腸壁吸收和食糜排空速度的影響［25］。作為盲腸內(nèi)環(huán)境的重要參數(shù)，NH3－N濃度在一定程度上反映了盲腸微生物分解含氮物質(zhì)產(chǎn)氨的速度及其對氨的攝取利用情況，反映了特定飼糧組成下蛋白質(zhì)降解與合成之間所達到的平衡關(guān)系［26］。本試驗結(jié)果表明，飼糧添加10和20mg/kg鹽酸小檗堿可提高肉兔盲腸微生物利用碳架和氨合成MCP的效率，而MCP濃度的測定結(jié)果也印證了這一點。榮娜［27］給安裝盲腸瘺管的獺兔飼喂鹽酸小檗堿添加量分別為0、10、20及30mg/kg的飼糧，結(jié)果表明，飼糧添加小檗堿不會引起盲腸內(nèi)容物pH的改變，但會提高 MTD活性，降低NH3－N濃度，促進MCP的合成，這與本試驗結(jié)果一致。

4 結(jié) 論

① 在本試驗條件下，飼糧添加小檗堿可改善肉兔對飼糧中DM、OM、CF、EE、GE和氮的利用效率，提高盲腸內(nèi)容物MTD活性和MCP濃度，降低 NH3－N 濃度。

② 綜合而言，肉兔飼糧中添加20mg/kg鹽酸小檗堿較為適宜。

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