蘭時(shí)樂(lè) 毛小偉 肖調(diào)義 王紅權(quán) 鄧元元 譚 斌

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，長(zhǎng)沙410128）

菜籽粕在我國(guó)的年產(chǎn)量在600萬(wàn)t左右［1］，是一種潛在營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高的植物蛋白質(zhì)資源［2－3］。由于菜籽粕中含有硫代葡萄糖甙，在芥子酶作用下 產(chǎn) 生 唑 烷 硫 酮（OZT）、異 硫 氰 酸 酯（ITC）等有毒物質(zhì)以及植酸、單寧等抗?fàn)I養(yǎng)因子，其中OZT、ITC等能損害動(dòng)物甲狀腺功能，可能造成牲畜中毒死亡［4］。據(jù)齊廣海等［5］預(yù)測(cè)，到2020年中國(guó)蛋白質(zhì)飼料的供需缺口將達(dá)到4 800萬(wàn)t。因此，研究開(kāi)發(fā)綠色、安全的可部分或全部替代魚(yú)粉等的蛋白質(zhì)飼料，無(wú)疑會(huì)對(duì)我國(guó)畜牧業(yè)的發(fā)展起到積極的推動(dòng)作用。為改善菜籽粕的飼用價(jià)值，國(guó)內(nèi)外許多研究工作者進(jìn)行了大量的研究。菜籽粕脫毒的方法主要有物理、化學(xué)及微生物發(fā)酵等脫毒方法［6－7］。由于物理和化學(xué)脫毒法投資大、技術(shù)發(fā)展不成熟或直接影響飼料的適口性等，均難以工業(yè)化生產(chǎn)。采用微生物固態(tài)發(fā)酵對(duì)菜籽粕脫毒并應(yīng)用于動(dòng)物養(yǎng)殖的研究，國(guó)內(nèi)外已有大量報(bào)道［8－12］，主要集中在脫毒菌種的篩選和混菌發(fā)酵條件的簡(jiǎn)單優(yōu)化［13－14］?；诓俗哑晒虘B(tài)發(fā)酵脫毒過(guò)程影響因素較多，且將菜籽粕發(fā)酵脫毒后作為畜禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖大宗飼料的生產(chǎn)過(guò)程參數(shù)優(yōu)化的報(bào)道較少，因此確定其最優(yōu)發(fā)酵脫毒過(guò)程參數(shù)尤為重要。本研究采用混合菌劑固體發(fā)酵菜籽粕，生產(chǎn)無(wú)毒菜籽粕飼料。采用Box－Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)完成整個(gè)優(yōu)化過(guò)程，確定其最佳發(fā)酵脫毒條件，以降低菜籽粕中硫代葡萄糖苷的含量。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 發(fā)酵菌種

發(fā)酵菌種由本實(shí)驗(yàn)室自行研制，主要由枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、納豆芽孢桿菌（Bacillus natto）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、側(cè)胞芽孢桿菌（Bacillus lateraporus）、丁酸梭狀芽孢桿菌（Clostridium butyricum）及酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）組成，各菌種的比例為1∶1∶1∶1∶2∶1。粉末狀固體，活菌數(shù)＞1010CFU/g。

1.1.2 培養(yǎng)基

菌種活化培養(yǎng)基（牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基）：牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，氯化鈉0.5%，瓊脂1.5%～2.0%，pH 7.0～7.2，121℃滅菌25min。

液體種子培養(yǎng)基：牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，氯化鈉0.5%，葡萄糖5%，pH 7.0～7.2，45 ℃滅菌25min。

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基主要成分包括菜籽粕、麥麩、葡萄糖、硫酸銨，由湘北水產(chǎn)飼料有限公司提供。菜籽粕的硫代葡萄糖苷含量為3.74mg/g。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種培養(yǎng)

斜面菌種培養(yǎng)：將保存于冰箱的斜面菌種接種于新鮮斜面培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)36h。

液體菌種培養(yǎng)：將培養(yǎng)36h的斜面菌種分別接種于液體菌種培養(yǎng)基中，37℃、150r/min條件下振蕩培養(yǎng)18～24h。

1.2.2 固態(tài)發(fā)酵脫毒培養(yǎng)

按比例稱(chēng)取粉碎至20目的菜籽粕和麥麩10kg于塑料桶中（容積為15L），將葡萄糖和硫酸銨溶于水后加入菜籽粕中，調(diào)節(jié)含水量和pH，按要求接入培養(yǎng)好的液體菌種，攪拌均勻，置于不同溫度下靜置發(fā)酵5d，發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)翻料和通風(fēng)控制發(fā)酵溫度。

1.2.3 發(fā)酵條件研究

1.2.3.1 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以葡萄糖和硫酸銨添加量、料水比、接種量、起始pH、發(fā)酵溫度及發(fā)酵時(shí)間為單因素，考察其對(duì)硫代葡萄糖苷降解率的影響。每組試驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)。

分別在固體發(fā)酵培養(yǎng)基中加入0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%的葡萄糖，其他條件不變，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定發(fā)酵物料中的硫代葡萄糖苷的含量，并計(jì)算其降解率。

分別在固體發(fā)酵培養(yǎng)基中加入0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%的硫酸銨，其他條件不變，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定發(fā)酵物料中的硫代葡萄糖苷的含量，并計(jì)算其降解率。

調(diào)節(jié)起始料水比分別為1.00∶0.35、1.00∶0.40、1.00∶0.45、1.00∶0.50、1.00∶0.55、1.00∶0.60 和1.00∶0.65，其他條件不變，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定發(fā)酵物料中的硫代葡萄糖苷的含量，并計(jì)算其降解率。

用稀酸或稀堿分別調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和8.5，在 上 述 獲 得 適宜的發(fā)酵條件基礎(chǔ)上，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定發(fā)酵物料中的硫代葡萄糖苷的含量，并計(jì)算其降解率。

分別選擇30、35、40、45、50和55℃作為發(fā)酵溫度，其他條件不變，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定發(fā)酵物料中的硫代葡萄糖苷的含量，并計(jì)算其降解率。

將培養(yǎng)好的固體菌種按3%、4%、5%、6%、7%、8%的接種量接入固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，其他條件不變，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定發(fā)酵物料中的硫代葡萄糖苷的含量，并計(jì)算其降解率。

根據(jù)發(fā)酵溫度、料水比、起始pH、接種量、葡萄糖和硫酸銨添加量對(duì)硫代葡萄糖苷的降解效果結(jié)果，研究發(fā)酵時(shí)間對(duì)硫代葡萄糖苷降解效果的影響。

1.2.3.2 最佳發(fā)酵條件研究

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Design Expert 7.1.6軟件，根據(jù) Box－Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取影響較大的接種量、發(fā)酵溫度、料水比和發(fā)酵時(shí)間4因素，建立硫代葡萄糖苷降解率與各因素之間的數(shù)學(xué)模型，通過(guò)計(jì)算來(lái)優(yōu)化最佳的發(fā)酵條件，以確定菜籽粕發(fā)酵脫毒的最佳條件。

1.2.4 測(cè)定方法

將發(fā)酵好的菜籽粕于55～60℃條件下烘干，粉碎至80目后進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)測(cè)定。

硫代葡糖糖苷降解率按照王寧惠［15］的方法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算公式為：

硫代葡糖糖苷降解率（%）＝（發(fā)酵前硫代葡糖糖苷

含量－發(fā)酵后硫代葡糖糖苷含量）/發(fā)酵前硫代葡糖糖苷含量×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

單因素試驗(yàn)篩選最適葡萄糖添加量、硫酸銨添加量、起始pH、料水比、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度等對(duì)硫代葡萄糖苷降解率的影響。

2.1.1 葡萄糖添加量對(duì)硫代葡萄糖苷降解率的影響

由表1可見(jiàn)，隨著葡萄糖添加量的增加，硫代葡萄糖苷降解率也隨之增加，當(dāng)葡萄糖添加量為1.0%時(shí)，硫代葡萄糖苷降解率到達(dá)77.31%，但葡萄糖添加量超過(guò)1.0%，硫代葡萄糖苷降解率明顯下降。其主要原因是葡萄糖添加量過(guò)大，改變了發(fā)酵培養(yǎng)基的碳氮比（C/N），從而影響了微生物酶的合成和分泌。

表1 葡萄糖添加量對(duì)硫代葡萄糖苷降解率的影響Table 1 Effects of glucose addition on degradation rate of glucosinolate %

2.1.2 硫酸銨添加量對(duì)硫代葡萄糖苷降解率的影響

由表2可見(jiàn)，硫酸銨添加量為0.5%時(shí)，硫代葡萄糖苷降解率最高，達(dá)到77.53%，故選擇硫酸銨最適添加量為0.5%。

表2 硫酸銨添加量對(duì)硫代葡萄糖苷降解率的影響Table 2 Effects of（NH4）2SO4addition on degradation rate of glucosinolate %

2.1.3 料水比對(duì)硫代葡萄糖苷降解率的影響

由表3可見(jiàn)，隨著料水比的增加，硫代葡萄糖苷降解率增加，當(dāng)料水比為1.00∶0.55時(shí)，硫代葡萄糖苷降解率為81.38%。但料水比超過(guò)1.00∶0.55，硫代葡萄糖苷降解率明顯下降。水是微生物進(jìn)行生命活動(dòng)不可缺少的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，但物料中含水量太低，培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不能得到充分的溶解而影響微生物對(duì)其的吸收和利用；而物料中含水量太高時(shí)，導(dǎo)致培養(yǎng)基的通透性降低而影響氧氣的傳遞，同樣影響微生物的生長(zhǎng)和代謝，進(jìn)而影響硫代葡萄糖苷的降解。

表3 料水比對(duì)硫代葡萄糖苷降解率的影響Table 3 Effects of the ratio of substrate to water on degradation rate of glucosinolate %

2.1.4 起始pH對(duì)硫代葡萄糖苷降解率的影響

培養(yǎng)基的酸堿度是影響微生物生長(zhǎng)和代謝的主要因素之一，適宜的酸堿度有利于微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用及代謝。由表4可知，培養(yǎng)基酸堿度過(guò)高或過(guò)低都對(duì)硫代葡萄糖苷降解率有較明顯的影響，當(dāng)起始pH為6.0時(shí)，硫代葡萄糖苷的降解率達(dá)到79.04%。

2.1.5 發(fā)酵溫度對(duì)硫代葡萄糖苷降解率的影響

不同的微生物都有其適宜的生長(zhǎng)溫度和酶最佳反應(yīng)溫度，在混合菌發(fā)酵中必須都處在一個(gè)適宜的溫度才能發(fā)揮各菌的優(yōu)勢(shì)，否則達(dá)不到混菌發(fā)酵的目的。由表5可見(jiàn)，當(dāng)發(fā)酵溫度為45℃時(shí)，硫代葡萄糖苷降解率最高，達(dá)到82.34%，溫度升高，硫代葡萄糖苷降解率下降。

表4 起始pH對(duì)硫代葡萄糖苷降解率的影響Table 4 Effects of initial pH value on degradation rate of glucosinolate %

表5 發(fā)酵溫度對(duì)硫代葡萄糖苷降解率的影響Table 5 Effects of cultural temperature on degradation rate of glucosinolate %

2.1.6 接種量對(duì)硫代葡萄糖苷降解率的影響

由表6可知，隨著接種量的增大，硫代葡萄糖苷降解率增加，當(dāng)接種量為7%時(shí)，硫代葡萄糖苷降解率為82.32%。因?yàn)檫m宜的接種量可以縮短菌種生長(zhǎng)的延遲期，使降解硫代葡萄糖苷的酶系提前合成和分泌，但過(guò)大的接種量會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)過(guò)快消耗，且代謝副產(chǎn)物的積累較多，從而改變微生物生長(zhǎng)和代謝的環(huán)境條件，影響酶系的合成。因此，采用7%的接種量較為適宜。

表6 接種量對(duì)硫代葡萄糖苷降解率的影響Table 6 Effects of inoculation amount on degradation rate of glucosinolate %

2.1.7 發(fā)酵時(shí)間對(duì)硫代葡萄糖苷降解率的影響

由表7可見(jiàn)，發(fā)酵前期是菌種生長(zhǎng)期，硫代葡萄糖苷降解率隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)提高較快，至發(fā)酵168h，硫代葡萄糖苷降解率達(dá)93.16%，發(fā)酵144h后，硫代葡萄糖苷降解率增加較為緩慢。主要原因是隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)逐步消耗，微生物生長(zhǎng)和代謝速度變慢，酶分泌量減少，導(dǎo)致硫代葡萄糖苷降解率增加量降低。綜合考慮，選擇適宜的發(fā)酵時(shí)間為144h。

表7 發(fā)酵時(shí)間對(duì)硫代葡萄糖苷降解率的影響Table 7 Effects of fermentation time on degradation rate of glucosinolate %

2.2 響應(yīng)面發(fā)酵條件優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取接種量、發(fā)酵溫度、料水比和發(fā)酵時(shí)間對(duì)硫代葡萄糖苷降解率影響較大的4個(gè)因素，硫代葡萄糖苷降解率為響應(yīng)值，每個(gè)因素取3個(gè)水平，進(jìn)行響應(yīng)面分析設(shè)計(jì)和試驗(yàn)，進(jìn)一步優(yōu)化各因素的參數(shù)值。各因素水平的編碼表見(jiàn)表8。

經(jīng)軟件Design Expert 7.1.6設(shè)計(jì)響應(yīng)面分析試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表9。

表8 試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平及編碼Table 8 Design of experimental factors and codes

表9 Box－Benhnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 9 Box－Benhnken response surface design and results

根據(jù)表9試驗(yàn)結(jié)果，采用 Design－Expert 7.1.6軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。由表10可知，X1、X2、X3、X4、X21、X22、X23、X24對(duì) 硫 代 葡 萄 糖 苷 降 解 率（Y）的影響極顯著（P＜0.000 1），說(shuō)明接種量、發(fā)酵溫度、料水比和發(fā)酵時(shí)間是發(fā)酵過(guò)程中的重要因素，但交互作用不顯著（P＞0.05）。失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），說(shuō)明數(shù)據(jù)中沒(méi)有異常點(diǎn)，模型適當(dāng)。

表10 響應(yīng)面結(jié)果方差分析Table 10 Analysis of variance of experimental results of response surface

用Design－Expert 7.1.6軟件分析模型的可信 度，結(jié)果見(jiàn)表11。

表11 二次回歸方程的方差分析Table 11 Analysis of variance of the quadratic model

根據(jù)響應(yīng)面系數(shù)的回歸分析，得到該次模型的擬合方程為：Y＝94.215 9＋1.463 8 X1－2.597 1X2＋1.427 0X3＋1.822 2X4＋0.435 3X1X2－0.068 9X1X3＋0.024 7X1X4＋0.218 5X2X3－0.192 4 X2X4＋0.660 8 X3X4－3.382 6 X21－6.827 7 X22－1.864 7 X23－5.378 9 X24?；貧w方程的方差分析結(jié)果見(jiàn)表10、表11。從表10、表11可以看出，回歸模型極顯著（P＜0.001），失擬項(xiàng)不顯著（P＝0.973 6），表明回歸方程擬合度良好；回歸方程的復(fù)相關(guān)系數(shù)為0.990 0，表明99.00%的硫代葡萄糖苷降解率變化可由此模型解釋?zhuān)c實(shí)際情況擬合很好；校正相關(guān)系數(shù)為0.978 4。硫代葡萄糖苷降解率變異系數(shù)為0.74%，信噪比為34.328，說(shuō)明模型可信度較高。該方程為菜籽粕混合菌發(fā)酵脫毒提供了一個(gè)合適的模型，因此可用上述模型代替真實(shí)試驗(yàn)點(diǎn)對(duì)混合菌發(fā)酵菜籽粕脫毒進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

2.2.2 響應(yīng)面分析

采用Design Expert 7.1.6軟件對(duì)回歸模型進(jìn)行規(guī)范分析，接種量、發(fā)酵溫度、料水比和發(fā)酵時(shí)間4個(gè)因素交互影響硫代葡萄糖苷降解率的響應(yīng)面圖和等高線(xiàn)圖見(jiàn)圖1～圖6。

圖1 發(fā)酵溫度和接種量對(duì)硫代葡萄糖苷降解率影響的相應(yīng)面圖和等高線(xiàn)圖Fig.1 Response surface and contour graph of the effects of fermentation temperature and inoculation amount on degradation rate of glucosinolate

圖2 料水比和接種量對(duì)硫代葡萄糖苷降解率影響的相應(yīng)面圖和等高線(xiàn)圖Fig.2 Response surface and contour graph of the effects of ratio of substrate to water and inoculation amount on degradation rate of glucosinolate

圖3 發(fā)酵時(shí)間和接種量對(duì)硫代葡萄糖苷降解率的影響相應(yīng)面圖和等高線(xiàn)圖Fig.3 Response surface and contour graph of the effects of fermentation time and inoculation amount on degradation rate of glucosinolate

圖4 發(fā)酵溫度和料水比對(duì)硫代葡萄糖苷降解率影響的相應(yīng)面圖和等高線(xiàn)圖Fig.4 Response surface and contour graph of the effects of fermentation temperature and ratio of subtrate to water on degradation rate of glucosinolate

圖5 發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間對(duì)硫代葡萄糖苷降解率影響的相應(yīng)面圖和等高線(xiàn)圖Fig.5 Response surface and contour graph of the effects of fermentation temperature and fermentation time on degradation rate of glucosinolate

圖6 發(fā)酵時(shí)間和料水比對(duì)硫代葡萄糖苷降解率影響的相應(yīng)面圖和等高線(xiàn)圖Fig.6 Response surface and contour graph of the effects of fermentation time and ratio of substrate to water on degradation rate of glucosinolate

等高線(xiàn)的形狀可以反映出因素之間交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，圓形表示兩因素不顯著，而橢圓則表示較為顯著［16］。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間和接種量處于最佳水平時(shí)，發(fā)酵溫度和接種量的交互作用見(jiàn)圖1。

由圖1可以看出，隨著發(fā)酵溫度升高，硫代葡萄糖苷降解率先上升后迅速下降；隨著接種量增加，硫代葡萄糖苷降解率先上升后下降，說(shuō)明發(fā)酵溫度和接種量存在顯著的交互作用。當(dāng)發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間處于最佳水平時(shí)，料水比和接種量的交互作用見(jiàn)圖2。由圖2可以看出，隨著料水比和接種量的增加，硫代葡萄糖苷降解率呈先迅速上升后下降的趨勢(shì)，但接種量較大時(shí)，硫代葡萄糖苷降解率較料水比增加下降明顯，說(shuō)明二者對(duì)硫代葡萄糖苷降解率有顯著的影響。當(dāng)發(fā)酵溫度和料水比處于最佳水平時(shí)，發(fā)酵時(shí)間和接種量的交互作用見(jiàn)圖3。由圖3可以看出，隨著發(fā)酵時(shí)間和接種量的延長(zhǎng)和增加，硫代葡萄糖苷降解率呈先迅速上升后明顯下降趨勢(shì)，說(shuō)明二者對(duì)硫代葡萄糖苷降解率有極顯著的影響，二者交互作用形成的曲面為拋物面，也說(shuō)明發(fā)酵時(shí)間和接種量之間存在交互作用。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間和接種量處于最佳水平時(shí)，發(fā)酵溫度和料水比的交互作用見(jiàn)圖4。由圖4可以看出，當(dāng)發(fā)酵溫度較低時(shí)，硫代葡萄糖苷降解率隨著發(fā)酵溫度的升高而升高，而發(fā)酵溫度超過(guò)＋0.5水平時(shí)，硫代葡萄糖苷降解率迅速下降；硫代葡萄糖苷降解率隨料水比增加而升高，在接近＋1.0水平時(shí)有所下降。這說(shuō)明發(fā)酵溫度和料水比對(duì)硫代葡萄糖苷降解率有顯著的影響。當(dāng)接種量和料水比處于最佳水平時(shí)，發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間的交互作用見(jiàn)圖5。由圖5可以看出，隨著發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間的提高和延長(zhǎng)，硫代葡萄糖苷降解率呈先迅速上升后迅速下降的趨勢(shì)，說(shuō)明二者對(duì)硫代葡萄糖苷降解率有極顯著的影響。當(dāng)發(fā)酵溫度和接種量處于最佳水平時(shí)，發(fā)酵時(shí)間和料水比的交互作用見(jiàn)圖6。由圖6可以看出，發(fā)酵時(shí)間和料水比交互作用顯著。

2.2.3 顯著因素水平優(yōu)化

運(yùn)用Design Expert 7.1.6對(duì)回歸模型進(jìn)行進(jìn)行規(guī)范性分析，尋求最大硫代葡萄糖苷降解率的穩(wěn)定點(diǎn)及對(duì)應(yīng)的因素水平，結(jié)合圖1～圖6給出的回歸方程的三維響應(yīng)面圖以及等高線(xiàn)圖可知，回歸模型存在穩(wěn)定點(diǎn)，穩(wěn)定點(diǎn)即最大值。對(duì)回歸方程分別求一階偏導(dǎo)等于零，結(jié)果如下：

1.4638－6.765 2 X1＋0.435 3 X2－0.068 8 X3＋0.024 7 X4＝0，

－2.597 1＋0.435 3 X1－13.655 3 X2＋0.218 5 X3－0.192 4 X4＝0，

1.4270－0.068 9 X1＋0.218 5 X2－3.729 4 X3＋0.660 8 X4＝0，

1.8222＋0.024 7 X1－0.192 4 X2＋0.660 8 X3－10.757 9 X4＝0。

解方程組得到模型的最佳因素編碼為：X1＝0.204 1，X2＝－0.180 1，X3＝0.403 4，X4＝0.197 8，將其代入回歸方程，得到預(yù)測(cè)硫代葡萄糖苷降解率最大值為94.925 1%。各個(gè)編碼所對(duì)應(yīng)的 X1、X2、X3、X4實(shí)際取值為接種量為7.7%，發(fā)酵溫度為44.1℃，料水比1.000∶0.585，發(fā)酵時(shí)間52.6h。

2.2.4 模型的驗(yàn)證

為了驗(yàn)證模型的有效性，根據(jù)優(yōu)化試驗(yàn)所得的各因素優(yōu)化值，即接種量7.7%，發(fā)酵溫度44℃，料水比1.000∶0.585，發(fā)酵時(shí)間53h條件下進(jìn)行菜籽粕脫毒發(fā)酵試驗(yàn)，重復(fù)3次試驗(yàn)，測(cè)得的硫代葡萄糖苷降解率平均值為94.850 6%（表12）。與理論預(yù)測(cè)值94.925 1%接近，相對(duì)誤差為0.078%，可見(jiàn)該模型能較好地預(yù)測(cè)菜籽粕發(fā)酵脫毒情況。

表12 響應(yīng)面試驗(yàn)的驗(yàn)證Table 12 Certification of response surface experiment

3 討 論

本文通過(guò)優(yōu)化菜籽粕作為主要基質(zhì)混合菌種固體發(fā)酵脫毒生產(chǎn)畜禽及水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料的發(fā)酵過(guò)程參數(shù)，建立了關(guān)鍵因子影響硫代葡萄糖苷的二次多項(xiàng)數(shù)學(xué)模型，系統(tǒng)研究并確定了菜籽粕固體發(fā)酵脫毒的工藝條件，為實(shí)現(xiàn)菜籽粕微生物發(fā)酵脫毒工業(yè)化生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)得到了接種量、發(fā)酵溫度、料水比和發(fā)酵時(shí)間對(duì)硫代葡萄糖苷降解率影響的數(shù)學(xué)模型：Y＝94.215 9＋1.463 8 X1－2.597 1 X2＋1.427 0 X3＋1.822 2 X4＋0.435 3 X1X2－0.068 9 X1X3＋0.024 7 X1X4＋0.218 5 X2X3－0.192 4 X2X4＋0.660 8X3X4－3.382 6X21－6.827 7X22－1.864 7X23－5.378 9 X24。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，該模型的相關(guān)系數(shù)R2＝0.978 4，模型與實(shí)際情況符合很好，證明該模型能反映出4個(gè)因子對(duì)混合菌固體發(fā)酵菜籽粕硫代葡萄糖苷降解率的影響。硫代葡萄糖苷降解率變異系數(shù)為0.74%，信噪比為34.328，說(shuō)明試驗(yàn)的可靠性較高，此模型能較好地反映試驗(yàn)結(jié)果。

微生物發(fā)酵菜籽粕脫毒的關(guān)鍵是菌種選擇，不同微生物菌種對(duì)硫代葡糖糖苷的降解能力不同，篩選優(yōu)良的微生物菌種是影響菜籽粕脫毒效果的首要條件。在國(guó)內(nèi)外所采用的微生物脫毒法中，大多是采用單一或復(fù)合菌種進(jìn)行固體發(fā)酵［9，13，17－22］，除了微 生 物 菌 種 的 影 響 外，固 體 發(fā) 酵過(guò)程中基質(zhì)的含水量、pH、輔料添加、通氣量、溫度、培養(yǎng)基的組成等對(duì)發(fā)酵效果有著很大的影響［23－24］。蔣玉琴等［9］利用乳酸菌、酵母菌、少孢子根霉菌混合培養(yǎng)得到的復(fù)合菌系發(fā)酵菜籽粕，在pH 4.7、含水量85%～90%條件下發(fā)酵32h，硫代葡萄糖苷降解率達(dá)71.6%；陸豫等［10］使用白地霉和米曲霉脫毒菜籽粕，在料水比1∶2，29℃發(fā)酵47 h，硫代葡萄糖苷降解率達(dá)97.0%；孫林等［25］比較植物乳桿菌、枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌及酪酸梭狀芽孢桿菌對(duì)硫代葡萄糖苷降解情況，其中以植物乳桿菌降解效果最好，適宜條件下48h硫代葡萄糖苷降解率可達(dá)85.19%；李延海等［26］利用白地霉K對(duì)菜籽餅進(jìn)行微生物發(fā)酵脫毒試驗(yàn)研究，ITC、OZT含量分別降低了83.81%、83.19%。本研究結(jié)果表明，在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，選用接種量、料水比、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間采用響應(yīng)面法對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，菜籽粕中硫代葡萄糖苷降解率達(dá)94.850 6%，高于國(guó)內(nèi)外報(bào)道的有關(guān)菜籽粕發(fā)酵脫毒的文獻(xiàn)資料結(jié)果。

4 結(jié) 論

① 菜籽粕脫毒的最優(yōu)條件為：接種量7.7%，發(fā)酵溫度44.1℃，料水比1.000∶0.585，發(fā)酵時(shí)間52.6h，硫代葡萄糖苷降解率最高為94.925 1%。

② 通過(guò)驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得硫代葡萄糖苷平均降解率為94.850 6%，與理論預(yù)測(cè)值相比，相對(duì)誤差僅為0.078%，說(shuō)明模型能較好地預(yù)測(cè)混合菌固體發(fā)酵菜籽粕脫毒的實(shí)際情況，具有較強(qiáng)的生產(chǎn)指導(dǎo)意義。

［1］ 蔣新正.我國(guó)大豆、菜籽、花生等油料、油脂、餅粕的供需情況分析［J］.中國(guó)油脂，2002，27（6）：73－74.

［2］ 張宗舟.發(fā)酵法菜籽餅脫毒機(jī)理研究［J］.中國(guó)醫(yī)學(xué)生物技術(shù)應(yīng)用雜志，2004，3（3）：34－38.

［3］ LEWIS A J，BAYLEG H S.Bioavailability of nutrients for animals：amino acids，minerals and vitamins［M］.New York：Academic Press Inc.，1997：35－65.

［4］ TRIPATHI M K，MISHRA A S.Glucosinolates in animal nutrition：a review［J］.Animal Feed Science and Technology，2007，132（1/2）：1－27.

［5］ 齊廣海，武書(shū)庚，李東.加入 WTO我國(guó)飼料工業(yè)科技發(fā)展戰(zhàn)略與方向（上）［J］.飼料廣角，2002（3）：33－35.

［6］ 蘇李偉.菜籽餅微生物脫毒生產(chǎn)高效蛋白飼料的可行性分析［J］.新疆畜牧業(yè)，1998（4）：32－33.

［7］ 張宗舟，趙萍，岳達(dá)昌.菜籽餅去毒方法分析與評(píng)價(jià)［J］.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1991（4）：433－436.

［8］ ROZAN F，VILIAUME C，BAU H M.Detoxication of rapeseed meal by rhizopusoligosorus sp－t3－a first steptowards rapeseed protein concentrate［J］.Intemational Journal of Food Science ＆Technology，1996，3l（1）：85－90.

［9］ 蔣玉琴，李榮林，邵明減，等.復(fù)合菌脫毒菜籽餅粕及其應(yīng)用研究Ⅰ：不同處理?xiàng)l件下復(fù)合菌體系發(fā)酵對(duì)菜籽餅粕硫甙的降解［J］.江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，1999，5（2）：104－106.

［10］ 陸豫，余勃.發(fā)酵菜籽粕脫毒工藝優(yōu)化研究［J］.食品科學(xué)，2007，28（10）：267－27l.

［11］ CHIOU P W S，CHEN C，YU B.Effects of Aspergillus oryzae fermentation extract on in situ degradation of feedstuffs［J］.Asian－Australasian Journal of Animal Sciences，2000，13（8）：1076－1083.

［12］ FRANKE K，MEYER U，WAGNER H，et a1.Influence of various iodine supplementation levels and two different iodine species on the iodine content of the milk of cows fed rapeseed meal or distillers dried grains with solubles as the protein source［J］.Journal of Dairy Science，2009，92：4514－4523.

［13］ 葉龍祥，牛興亮.菜籽粕混菌發(fā)酵脫毒研究［J］.糧食與食品工業(yè)，2010，17（4）：41－44.

［14］ 何國(guó)菊，李學(xué)剛，趙海伶.菜籽餅粕脫毒工藝參數(shù)的研究［J］.中國(guó)油脂，2003，28（12）：23－26.

［15］ 王寧惠.油菜籽（餅粕）中硫代葡萄糖甙總量速測(cè)方法－氯化鈀法［J］.青海農(nóng)林科技，2009（3）：58－59.

［16］ 毋銳琴，杜雙奎，李志西，等.細(xì)菌纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化及超微觀(guān)結(jié)構(gòu)分析［J］.生物工程學(xué)報(bào)，2008，24（6）：1068－1074.

［17］ LENZ J，HOFER M，KRASENBRINK J B，et al.A survey of computational and physical methods applied to solid－state fermentation［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2004，65：9－17.

［18］ DE REU J C，ZWIETERING M H，ROMBOUTS F M，et al.Temperature control in solid substrate fermentation through discontinuous rotation［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，1993，40：261－265.

［19］ 謝建坤，張強(qiáng).菜籽餅發(fā)酵菌株篩選研究［J］.江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，1994，6（1）：75－81.

［20］ 鐘世榮，余伯良，林琦.菜籽餅粕與醬油渣混合發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料的研究［J］.糧食與飼料工業(yè)，2001（8）：27－29.

［21］ 張宗周.菜籽餅生物脫毒的微生物篩選復(fù)配、脫毒機(jī)理與應(yīng)用效果研究［D］.博士學(xué)位論文.蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2003.

［22］ VIG A P，WALIA A.Beneficial effects of rhizopus oligosporus fermentation on reduction ofglucosinolates，fiber and phytic acid in rapeseed（Brassicanapus）meal［J］.Bioresource Technology，2001，78：309－312.

［23］ RAKARIYATHAM N，SAKORN P.Biodegradation of glucosinolates in brown mustard seed meal（Brassicajuncea）by Aspergillus sp.NR－4201in liquid and solid－state cultures［J］.Biodegradation，2002（13）：395－399.

［24］ BAU H M，VILLAUME C，LIN C F，et a1.Effect of solid－state fermentation using Rhizopus oligosporus sp.T－3on elimination of antinutritional substances and modification of biochemical constituents of defatted rapeseed meal［J］.Journal of the Science of Food and Agriculture，1994，65（3）：315－322.

［25］ 孫林，李呂木，張邦輝，等.多菌種固態(tài)發(fā)酵菜籽粕的研究［J］.中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2009，24（1）：85－89.

［26］ 李延海，耿二強(qiáng).用微生物發(fā)酵脫毒菜籽粕［J］.中國(guó)飼料，1997（17）：35－36.