馬軍德，賈斌，馬世俊，申紅，張挺軍，付維明，蔡國(guó)寶

（1石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，石河子832003；2新疆兵團(tuán)第九師師機(jī)關(guān)，額敏834609；3新疆兵團(tuán)第九師165團(tuán)畜牧獸醫(yī)工作站，額敏834609）

哺乳動(dòng)物中，睪丸決定因子（TDF）位于異型個(gè)體的遺傳組中，并引起具有雙向潛能的性腺原基分化成睪丸［1］。在 Y染色體短臂（Yp11．3）靠近常染色體的區(qū)域上，存在一種可編碼鋅指蛋白的高度保守的基因序列，即鋅指結(jié)構(gòu)基因（Zinc－finger Y，Zfy）［2］。研究發(fā)現(xiàn)，在所有哺乳動(dòng)物個(gè)體中均可檢測(cè)到Zfy基因的序列，且Zfy－1存在于小鼠性別決定區(qū)域中，因此推測(cè)Zfy基因就是TDF［3］。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)Zfy基因是小鼠精子發(fā)生過程中的重要基因，位于Y染色體短臂上，在精母細(xì)胞粗線期到圓形精細(xì)胞的發(fā)育階段表達(dá)，圓形精細(xì)胞中的含量最高。其作為一個(gè)較強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄激活因子，能夠引導(dǎo)靶基因穿過核膜，定位于精子細(xì)胞核內(nèi)，可能在精子變態(tài)過程中對(duì)某些基因具有轉(zhuǎn)錄激活作用［4］，與精子的發(fā)生有關(guān)［5］。

RNA 干擾（RNA interference，RNAi）是由一些siRNA引起與其序列互補(bǔ)的單鏈RNA發(fā)生降解的現(xiàn)象。其可以高效特異地阻斷細(xì)胞內(nèi)特定基因的表達(dá)，促使特定基因mRNA降解，誘導(dǎo)細(xì)胞表現(xiàn)出特定基因缺失的表型［6］。實(shí)驗(yàn)研究用來表達(dá)siRNA的工具主要有質(zhì)粒載體和病毒載體［7］，其中質(zhì)粒載體最為常見。然而將載體有效地導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞一般需要借助轉(zhuǎn)染試劑，這種外源基因的導(dǎo)入方法因存在無法準(zhǔn)確地確定轉(zhuǎn)染效率、難以保證每次實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性、不能在體內(nèi)產(chǎn)生長(zhǎng)期的效應(yīng)，限制了它在哺乳動(dòng)物中的應(yīng)用［8］。利用病毒載體介導(dǎo)產(chǎn)生的小分子干擾RNA可以靶向感染宿主細(xì)胞實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定、高效的基因沉默效果，避免了由于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率低帶來的各種問題［9］。

本研究以逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pMIG為基礎(chǔ)，構(gòu)建一種新的RNA干擾逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，并以小鼠的Zfy基因?yàn)榘悬c(diǎn)，驗(yàn)證Zfy基因沉默效果，旨在為進(jìn)一步探究該基因在小鼠生精過程中的作用機(jī)制及功能奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也為研究生精過程中的其它基因提供了一種新的思路。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 試驗(yàn)動(dòng)物

昆明小鼠由石河子大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，按常規(guī)方法飼養(yǎng)及傳代，取25日齡左右的小鼠用于生精細(xì)胞的分離。

1．1．2 主要試驗(yàn)試劑及儀器

DMEM干粉培養(yǎng)基（Gibco），胎牛血清（FBS，Gibco），膠原酶IV（Sigma），透明質(zhì)酸（Sigma），胰蛋白酶（Amresco），非必須氨基酸（Gibco），丙酮酸（Sigma），及其它工作培養(yǎng)液；限制性內(nèi)切酶（EcoRⅠ、Bgl II）購自TaKaRa公司；無內(nèi)毒素質(zhì)粒試劑盒購自北京天根生化有限公司；氨芐青霉素購自沃德生物公司；高效轉(zhuǎn)染試劑盒（HET）購自百恩維生物科技有限公司；SYBR＠ Premix Ex TaqTM購自TaKaRa公司；逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pMIG、病毒包裝質(zhì)粒pUMVC及包膜質(zhì)粒VSVG，人胚腎細(xì)胞293T細(xì)胞，DH5α感受態(tài)細(xì)胞均有石河子大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存；細(xì)胞培養(yǎng)箱、熒光顯微鏡。

1．2 方法

1．2．1 逆轉(zhuǎn)錄病毒重組質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期設(shè)計(jì)篩選的Zfy基因RNA有效干擾序列，委托上海生工合成2條寡聚核苷酸：5′－AATTCCAACAGTGTGAGCTTCAAATTCAA GAGATTTGAAGCTCACACTGTTGTTTTTTGGA AA－3′和5′－GATCTTTCCAAAAAACAACAGTGTG AGCTTCAAATCTCTTGAATTTG AAGCTCACAC TGTTGG－3′。

該序列基本組成如下：酶切位點(diǎn)（EcoRⅠ）＋Sense＋loop＋Antisense＋終止信號(hào)＋酶切位點(diǎn)（Bgl II）?；パa(bǔ)的2條 Oligo DNA 分別溶于去離子水，稀釋成100μmol／L。分別加入與上述配對(duì)的上游、下游單鏈寡核苷酸片段，按照1∶1的比例進(jìn)行混合后，在PCR儀上以95℃30s，72℃2min，25℃2min的程序合成雙鏈DNA，稀釋保存?zhèn)溆谩?/p>

原質(zhì)粒pMIG－h(huán)oct3／4經(jīng) EcoRⅠ、Bgl II雙酶切，回收大片段。將2對(duì)正確合鏈的雙鏈shRNA模板分別與線性化載體進(jìn)行連接，16℃孵育過夜，轉(zhuǎn)化入DH5α，挑取陽性單克隆，酶切鑒定并送華大基因測(cè)序驗(yàn)證。測(cè)序鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pMIG／ZFY－siRNA。

1．2．2 逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的制備

將293T細(xì)胞種植于10cm細(xì)胞培養(yǎng)板中（約1×107個(gè)細(xì)胞），培養(yǎng)至待細(xì)胞狀態(tài)良好。將測(cè)序鑒定正確的pMIG／ZFY－siRNA質(zhì)粒與包裝質(zhì)粒pUMVC和包膜質(zhì)粒VSVG用高效轉(zhuǎn)染試劑盒（HET）共轉(zhuǎn)染至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期293T細(xì)胞，培養(yǎng)6～8h后換液并加入新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)立陰性空載體對(duì)照。72h后收集病毒上清于4℃，12000r／min離心10min以除去細(xì)胞碎片，應(yīng)用0．45m濾器過濾，置于15000r／min高速離心機(jī)離心90min。將獲得的病毒液分裝在病毒管中，－80℃保存?zhèn)溆?。取少量病毒原液采用孔稀釋法測(cè)定病毒滴度，稀釋后依次感染293T細(xì)胞，培養(yǎng)48h后通過觀察計(jì)數(shù)熒光量以測(cè)定和計(jì)算病毒滴度。包裝的病毒記為Viral vector／ZFY－siRNA，陰性對(duì)照記為 Negative control。

1．2．3 小鼠生精細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及病毒感染

選取25日齡左右的昆明小鼠頸椎脫臼法處死，75%的酒精進(jìn)行腹部皮膚消毒，置于超凈臺(tái)上切開皮膚及皮下組織取出雙側(cè)睪丸，放入冰冷的DHanks溶液中。剝除睪丸被膜，沖洗睪丸實(shí)質(zhì)，用D－Hanks沖洗2次，加入相當(dāng)于組織10倍體積的1 g／LⅣ型膠原酶＋20μg／mL DNAsePBS溶液在37℃5%CO2培養(yǎng)箱中15min，然后1000r／min離心1min后除去上清，用F12／DMEM洗滌2次，1000 r／min離心1min，將其剪碎成約1mm3大小。加入含1．5g／L透明質(zhì)酸酶和0．25%胰蛋白酶＋20 μg／mL DNAse的PBS 37℃5%CO2培養(yǎng)箱中10 min（在此期間，搖動(dòng)試管3次），以消化基底膜和管周細(xì)胞。倒置顯微鏡下見曲細(xì)精管段軟散，讓其消散成單細(xì)胞或小的細(xì)胞團(tuán)即可。加入含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的新鮮F12／DMEM培養(yǎng)液終止消化，吹打8～10次，制成單細(xì)胞懸液。用100μm濾網(wǎng)過濾后將濾液轉(zhuǎn)入離心管，1000r／min離心10 min輕輕的去除上清。用F12／DMEM洗滌2次（1000r／min離心10min去上清），將這些生精小管碎塊放入含10%胎牛血清的HamF12／DMEM培養(yǎng)液中，內(nèi)添加必需氨基酸、表皮生長(zhǎng)因子等，然后按約1×106個(gè)／cm2的密度接種于六孔板中，在32℃5%CO2、濕度為95%的條件下培養(yǎng)。24h后更換新鮮培養(yǎng)基，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況和形態(tài)變化，并采集圖像。待生精細(xì)胞融合度達(dá)70%～80%，生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，用包裝好的逆轉(zhuǎn)錄病毒和陰性對(duì)照分別對(duì)其進(jìn)行轉(zhuǎn)染，48h后在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果。

1．2．4 Zfy基因mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)

72h后，采用Trizol（美國(guó)Invitroger）法提取細(xì)胞RNA，由寶生物TaKaRa公司提供的反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA合成。利用熒光實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)Zfy基因的mRNA表達(dá)水平，所用目標(biāo)基因Zfy 引 物 上 游 序 列 為 5′－TTTCCGTCACCCATCAGCACTC－3′，下 游 為 5′－AAAGTCAGGAGACAGATGCCACA－3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為174bp。內(nèi)參基因 GAPDH 引 物 上 游 序 列 為 5′－ACCCAGAAGACTGTGGATGG－3′，下游為5′－CACATTGGGGGTAGGAACAC－3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為171bp。

熒光實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系的總體積為25 μL，其中包含SYBR＠ Premix Ex TaqTM（Perfect Real time染料法實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒）12．5μL，上下游引物（10μmol／L）各0．5μL，cDNA模板2μL，dd H2O 9．5μL。PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性30 s，95℃變性30s，61℃退火30s，72℃延伸15s，30個(gè)循環(huán)。試驗(yàn)對(duì)所有樣本進(jìn)行3個(gè)重復(fù)，并在每次試驗(yàn)時(shí)設(shè)ddH2O為陰性對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2．1 逆轉(zhuǎn)錄重組RNAi質(zhì)粒的酶切鑒定和測(cè)序驗(yàn)證

構(gòu)建的重組RNAi質(zhì)粒pMIG／ZFY－siRNA，經(jīng)轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α擴(kuò)增后，進(jìn)行雙酶切鑒定，經(jīng)酶切的重組質(zhì)粒出現(xiàn)2條帶，沒有進(jìn)行酶切的質(zhì)粒只有1條帶，說明目的基因已成功插入線性化載體pMIG中。篩選酶切鑒定正確的陽性克隆送華大基因公司測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果證實(shí)插入的序列與設(shè)計(jì)的序列完全一致，無堿基突變。測(cè)序結(jié)果見圖1。

2．2 病毒包裝及滴度測(cè)定

逆轉(zhuǎn)錄病毒重組質(zhì)粒pMIG／ZFY－siRNA、包裝質(zhì)粒pUMVC及包膜質(zhì)粒VSVG經(jīng)高效轉(zhuǎn)染試劑盒（HET）轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞后熒光顯微鏡下可見細(xì)胞表達(dá)綠色熒光蛋白（圖2a、b）。說明重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染至該細(xì)胞并已進(jìn)行病毒包裝，且轉(zhuǎn)染效率達(dá)80%左右。

根據(jù)孔稀釋法檢測(cè)熒光蛋白的表達(dá)量計(jì)算病毒滴度（TU／mL）＝熒光細(xì)胞率（%）×細(xì)胞總數(shù)×病毒液稀釋倍數(shù)／病毒液體積（mL），測(cè)定滴度為5×108TU／mL，可用于后期實(shí)驗(yàn)。

2．3 生精細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征及逆轉(zhuǎn)錄病毒感染效果

從睪丸經(jīng)組合酶法分離的生精細(xì)胞，24h后可見一些由多個(gè)細(xì)胞的聚集，形成的細(xì)胞集落生長(zhǎng)于支持細(xì)胞飼養(yǎng)層上，集落中的細(xì)胞大小均一、飽滿呈圓形，輪廓清晰，以單個(gè)或數(shù)個(gè)連在一起依次排列，細(xì)胞之間緊密連接呈念珠狀或團(tuán)狀，支持細(xì)胞擴(kuò)展開來，呈多角形或不規(guī)則形。細(xì)胞集落少數(shù)貼壁生長(zhǎng)，大部分以懸浮或半懸浮狀態(tài)生長(zhǎng)。待六孔板中培養(yǎng)的生精細(xì)胞數(shù)目達(dá)到70%～80%后，將包裝病毒和陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染入所培養(yǎng)的生精細(xì)胞。48h后經(jīng)熒光顯微鏡檢測(cè)熒光蛋白，可以達(dá)到40%以上的感染效果（圖3a、b）。

2．4 熒光實(shí)時(shí)定量測(cè)定Zfy基因mRNA的表達(dá)水平

利用qRT－PCR檢測(cè)經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)染后病毒干擾組與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組Zfy基因mRNA的表達(dá)水平。測(cè)定結(jié)果見圖4。

由測(cè)定結(jié)果（圖4）可以看出，轉(zhuǎn)染逆轉(zhuǎn)錄病毒的試驗(yàn)組，Zfy基因mRNA表達(dá)水平較陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組顯著下降（P＜0．01），而陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組Zfy基因mRNA表達(dá)水平無顯著性差異（P＞0．05）。

3 討論

Zfy／Zfx分別位于X／Y染色體上的特異性基因，它們是染色體上編碼鋅指蛋白的1對(duì)等位基因，從減數(shù)分裂期開始表達(dá)，在圓形精子細(xì)胞中的含量最高。Page等［10］明確指出Zfy基因與性別分化、精子發(fā)生有關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Zfy基因位于Y染色體短臂（Yp11．3）上，有11個(gè)外顯子和1個(gè)隨機(jī)重復(fù)區(qū)域的13個(gè)“鋅－指”結(jié)構(gòu)［11］，約有801個(gè)氨基酸，30個(gè)氨基酸殘基，由2個(gè)半胱氨酸和2個(gè)組氨酸配位1個(gè)鋅離子構(gòu)成［12］。它具有2個(gè)核定位信號(hào)區(qū)和DNA結(jié)合位點(diǎn)，能夠特異性的與靶基因結(jié)合，引導(dǎo)靶基因穿過核膜，定位于精子細(xì)胞核內(nèi)，其編碼蛋白可能作為轉(zhuǎn)錄因子，在精子形成過程中具有一定功能［13］。因此，本研究利用RNA干擾技術(shù)有效地抑制了生精細(xì)胞內(nèi)Zfy基因的表達(dá)，這一結(jié)果為進(jìn)一步探究Zfy基因在生精過程中的作用和功能奠定了基礎(chǔ)。

自從1998年Fire等［14］將dsRNA誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象命名為RNAi以來，這種可誘發(fā)高效基因沉默效應(yīng)的技術(shù)受到研究者的大力推廣并得到迅速發(fā)展。與傳統(tǒng)基因敲除技術(shù)、反義RNA技術(shù)及負(fù)性突變等基因沉默技術(shù)比較，RNAi具有特異性強(qiáng)、效率高、成本低、周期短、操作簡(jiǎn)單等不可比擬的優(yōu)勢(shì)［15－16］，因而被廣泛應(yīng)用于功能基因組研究、基因治療等領(lǐng)域。本實(shí)驗(yàn)利用siRNA介導(dǎo)的RNAi技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)靶基因Zfy表達(dá)的精細(xì)調(diào)控，達(dá)到了研究的目的，同時(shí)也為研究生精過程中其他相關(guān)基因的誘導(dǎo)調(diào)控開辟了新的思路。

質(zhì)粒和病毒載體介導(dǎo)的RNAi技術(shù)向哺乳動(dòng)物細(xì)胞中導(dǎo)入小分子干擾RNA（siRNA）能取得有效的基因沉默［17］。我們所使用的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pMIG多克隆位點(diǎn)中插入了綠色熒光蛋白，因此，通過熒光顯微鏡下的熒光強(qiáng)弱可以判斷siRNA的轉(zhuǎn)染效率。攜帶干擾片段的病毒載體進(jìn)入細(xì)胞后，siRNA將持續(xù)產(chǎn)生，并通過識(shí)別、降解具有同源序列的mRNA，最終干擾目的基因的表達(dá)；這種逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可以包裝成逆轉(zhuǎn)錄病毒，用于轉(zhuǎn)染比較難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系，從而提高了細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，拓寬了RNAi的應(yīng)用范圍。

采用適當(dāng)?shù)某绦蚣跋椒ㄊ欠蛛x良好單細(xì)胞懸浮液的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。由于曲細(xì)精管含有膠原纖維，大多研究采用了膠原酶消化法。本實(shí)驗(yàn)在參考相關(guān)文獻(xiàn)［18－20］方法的基礎(chǔ)上，采用組合酶法通過對(duì)酶濃度、消化時(shí)間探究，用低濃度膠原酶Ⅳ消散睪丸間質(zhì)并釋放大部分管周細(xì)胞，最低程度減少了間質(zhì)組織及管周細(xì)胞的污染；用胰蛋白酶消化時(shí)加機(jī)械吹打至組織塊完全消化為止，完全釋放出生精細(xì)胞和支持細(xì)胞。結(jié)果表明，這種程序性的消化過程能有效地分離到較為純粹的曲精細(xì)管段并制備出較高活率的單細(xì)胞懸液，同時(shí)確保絕大部分間質(zhì)成份、管周細(xì)胞及睪丸外細(xì)胞的去除。因此本研究認(rèn)為膠原酶和胰蛋白酶的組合是分離小鼠生精細(xì)胞較為簡(jiǎn)單、有效的方法。

逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染小鼠生精細(xì)胞并篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的單克隆細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)。采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)生精細(xì)胞中Zfy基因mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染逆轉(zhuǎn)錄病毒干擾載體的生精細(xì)胞中Zfy基因mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組極顯著降低，而轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組Zfy基因mRNA表達(dá)水平無明顯變化。說明本研究中的逆轉(zhuǎn)錄病毒RNAi載體能特異、高效地抑制目的基因Zfy表達(dá)，為進(jìn)一步研究Zfy基因的作用和功能奠定了基礎(chǔ)。

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