劉志方，吳長新，張輝，李蕊，郭吉星，肖紅冉，陳創(chuàng)夫

（石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，石河子832003）

主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）是Snell等在研究小鼠的移植排斥反應(yīng)時(shí)發(fā)現(xiàn)的，是由染色體上緊密連鎖、高度多態(tài)的基因位點(diǎn)組成的一個(gè)遺傳區(qū)域［1］。綿羊的MHC基因位于20號(hào)染色體上的q15～q23［2］，是識(shí)別自身與非自身抗原免疫反應(yīng)的多基因家族，在免疫應(yīng)答的啟動(dòng)和調(diào)節(jié)中發(fā)揮著十分重要的作用［3］，與動(dòng)物感染性疾病特別是病毒、細(xì)菌和寄生蟲的抵抗和易感性相關(guān)［4］。根據(jù)MHC抗原結(jié)構(gòu)和功能的不同可將MHC分為classⅠ、classⅡ和classⅢ三個(gè)區(qū)域，其編碼產(chǎn)物稱為綿羊白細(xì)胞抗原（OLA）或綿羊淋巴細(xì)胞抗原［5］。其中Ⅰ類基因編碼的產(chǎn)物稱為MHCⅠ類分子，是一種由α鏈和β鏈非共價(jià)結(jié)合組成的細(xì)胞表面糖蛋白，能識(shí)別結(jié)合內(nèi)源性的抗原肽，并將其遞呈給CD8＋T細(xì)胞，從而激發(fā)機(jī)體發(fā)生免疫反應(yīng)，與動(dòng)物的抗病能力有較強(qiáng)的相關(guān)性［6］。其中α鏈的α1和α2區(qū)域即由第二和第三外顯子編碼的區(qū)域是與抗原結(jié)合的區(qū)域，也是多態(tài)性最集中的區(qū)域，可能影響抗原結(jié)合區(qū)的空間結(jié)構(gòu)或通過影響T細(xì)胞受體的特異性識(shí)別等方式影響抗原遞呈過程的識(shí)別與被識(shí)別的特異性［4］，因可能與動(dòng)物疾病的抵抗及生產(chǎn)性能有一定的聯(lián)系而成為抗病育種研究的熱點(diǎn)。

有研究證明對(duì)某一毒力已知的病毒株的敏感程度取決于綿羊的品種，稱為品種敏感性［7］，同一品種綿羊的不同個(gè)體對(duì)于同一種病原的易感性也不同，這可能與綿羊MHCⅠ類分子對(duì)特定病原不同的遞呈能力相關(guān)。本文利用PCR和測序的方法對(duì)新疆哈薩克綿羊MHCⅠ類基因第二、三外顯子的序列多態(tài)性進(jìn)行了檢測與分析，旨在為以后研究綿羊MHCⅠ類分子對(duì)抗原的遞呈功能及抗病育種工作提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 材料

血液基因組提取試劑盒購自康為世紀(jì)生物公司；pMD－18－T載體購自 TaKaRa公司、LA Taq酶購自寶生物工程（大連）有限公司、dNTP、DNA凝膠回收試劑盒、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)購自北京天根生化科技有限公司；大腸桿菌DH5α為本實(shí)驗(yàn)室保存。其它試劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1．2 方法

1．2．1 采樣

從新疆伊犁地區(qū)隨機(jī)選擇健康哈薩克綿羊36只。每只綿羊頸靜脈無菌采取肝素鈉抗凝血5mL，低溫運(yùn)輸，－20℃保存。

1．2．2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)Gene Bank中綿羊MHC全基因組序列（登錄號(hào)為FJ985870），選取包含第二、三外顯子及部分側(cè)翼的內(nèi)含子部分序列，用Primer 5．0軟件設(shè)計(jì)引物：

上游引物為：5′－ACCGCCTCCATCTCATTG－3′；

下游引物為：5′－TGTCTTGTACAGAATCTG AAAA－3′。

引物由上海生物工程有限公司合成。

1．2．3 血液基因組DNA的提取

用血液基因組小提試劑盒提取基因組DNA，用分光光度儀和瓊脂糖凝膠電泳對(duì)其質(zhì)量和濃度進(jìn)行檢測，提取的基因組DNA在－20℃保存。

1．2．4 MHCⅠ類基因第二、三外顯子的擴(kuò)增及純化

以提取的血液基因組DNA為模板，PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；94℃變性30s、65℃退火40s，72℃ 延伸1min30s，35個(gè)循環(huán)；最后延伸72℃7min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1．2．5 MHCⅠ類基因第二、三外顯子的克隆及測序

將回收后的PCR產(chǎn)物與pMD－18－T載體連接，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)過氨芐抗性篩選挑取單克隆，經(jīng)菌液PCR鑒定后每個(gè)樣品挑選2～3個(gè)菌液PCR檢測陽性克隆菌，搖床37℃培養(yǎng)過夜后送上海生物工程有限公司測序。

1．2．6 序列分析

測序所得的核苷酸序列經(jīng)GenBank中BLAST比對(duì)，驗(yàn)證序列的正確性。核苷酸和氨基酸序列的統(tǒng)計(jì)分析利用 MEGA 5．0和 DNA SP4．0軟件完成。MEGA軟件中Kimura雙參數(shù)法（Gamma）法計(jì)算序列之間的遺傳距離（標(biāo)準(zhǔn)誤），同時(shí)還計(jì)算序列的轉(zhuǎn)換（transition）和顛換（transversion）數(shù)（率）。序列中的同義（dS）和非同義（dN）替換相對(duì)比例通過 MEGA軟件中用Jukes－Cantor（1969）校正 Nei Gojobori（1986）方法計(jì)算。利用 MEGA軟件中基于 Nucleotide：Jukes－Cantor模型的鄰近法（neighbor joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹（自舉檢驗(yàn)重復(fù)1000次）。

2 結(jié)果

2．1 MHCⅠ類基因第二、三外顯子的PCR擴(kuò)增

提取的DNA的260／280為1．8左右，濃度為22．6～104．5ng／μL。以樣品的基因組 DNA 為模版，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴(kuò)增產(chǎn)物為1074bp（圖1），與預(yù)期結(jié)果一致。其中包括內(nèi)含子1的部分序列、外顯子2序列270bp、內(nèi)含子2序列212bp、外顯子3序列276bp及內(nèi)含子3的部分序列。

2．2 pMD18－T－MHCⅠ重組質(zhì)粒的鑒定

PCR產(chǎn)物回收純化后連接pMD18－T載體，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)氨芐抗性篩選，菌液PCR后電泳檢測，觀察到1條大小為1074bp的目的條帶（圖2），與預(yù)期大小一致。陽性克隆測序結(jié)果與已知序列長度完全一致，重組質(zhì)粒命名為pMD18－T－MHCⅠ。

圖1 MHC I類基因第二、三外顯子PCR擴(kuò)增Fig．1PCR amplification of the exon2and 3of MHC I gene

2．3 測序結(jié)果分析

2．3．1 測序獲得的基因個(gè)數(shù)及頻率

圖2 pMD18－T－MHCⅠ PCR鑒定結(jié)果Fig．2PCR identification of pMD18－T－MHCⅠ

共獲得89個(gè)陽性克隆，其中第二外顯子序列16個(gè)、第三外顯子序列15個(gè)，各序列的頻率見表1、2。

表1 MHCⅠ類基因第二外顯子序列基因頻率Tab．1Gene frequencies of MHCⅠexon 2

表2 MHCⅠ基因第三外顯子序列基因頻率Tab．2Gene frequencies of MHCⅠ exon 3

2．3．2 序列之間的遺傳距離分析

從表3、4中可以看出，第二外顯子遺傳距離為0．005～0．063；第三外顯子遺傳距離為0．005～0．063。

表3 第二外顯子序列的遺傳距離及標(biāo)準(zhǔn)誤Tab．3Genetic distances and their standard errors among exon 2sequences

表4 第三外顯子序列的遺傳距離及標(biāo)準(zhǔn)誤Tab．4Genetic distances and their standard errors among exon 3sequences

2．3．3 序列核苷酸轉(zhuǎn)換、顛換分析

第二外顯子堿基組成存在一定的不平衡性，4種堿基A、T、C、G的平均含量分別為19．26%、14．86%、33．98%和31．90%，GC（65．88%）含量明顯高于AT（34．12%）含量。核苷酸之間存在著轉(zhuǎn)換和顛換現(xiàn)象，轉(zhuǎn)換、顛換之比R＝1．494。（K1＝3．698（purines），k2＝2．737（pyrimidines）；R＝［A＊G＊k1＋T＊C＊K2］／［（A＋G）＊（T＋C）］，說明第二外顯子變異種存在轉(zhuǎn)換偏倚現(xiàn)象。第三外顯子4種堿基 A、T、C、G平均含量分別為19．54%、16．26%、35．07%和29．13%，GC（64．20%）含量也明顯高于AT（35．80%）含量。R＝0．65，（K1＝1．153，k2＝1．732）（表5、6）。

表5 用極大似然估計(jì)模型計(jì)算的第二外顯子核苷酸替代概率Tab．5Maximum composite likehihood estimate of the pattern of nucleotide in exon 2

表6 用極大似然估計(jì)模型計(jì)算的第三外顯子核苷酸替代概率Tab．6Maximum composite likehihood estimate of the pattern of nucleotide in exon 3

2．3．4 核苷酸變異位點(diǎn)分析

由表7可見，外顯子二、三都有較多的多態(tài)位點(diǎn)，較高的核苷酸差異平均值及核苷酸多樣性。

表7 外顯子二、三的多態(tài)位點(diǎn)數(shù)、突變位點(diǎn)數(shù)、核苷酸差異平均值及多樣性Tab．7The nucleotide polymorphic positions，Mutant position，Kand Pi value

2．3．5 自然選擇性檢驗(yàn)

由表8中可見，第二外顯子的同義替換率略高于非同義替換率，但第三外顯子的非同義置換率卻略高于同義置換率，說明第二外顯子經(jīng)過了陰性選擇作用，而第三外顯子經(jīng)過了陽性選擇作用。

表8 dN和dS替換率、dN／dS比率和P值Tab．8Non－synonymous substitution（dN）rates，synonymous substitution（dS），dN／dS，and Pvalues

2．3．6 系統(tǒng)發(fā)生分析

圖3、4中以大寫字母H開頭的序列為測得的序列，其余序列為數(shù)據(jù)庫中牛MHCⅠ類基因的序列。圖3顯示哈薩克綿羊第二外顯子序列之間的同源性較高，聚類為3個(gè)大的分支：其中序列3、8、6、9、10、11、7、4、1、2和序列13聚為一類，與序列12、14、15、16之間的遺傳距離較遠(yuǎn)，但和牛的序列FJ952946．1有較近的遺傳距離；序列5與牛的序列中BC112510．1和BC151687．1有較近的遺傳距離，卻與測得的其它序列的遺傳距離較遠(yuǎn)；圖4顯示哈薩克綿羊第三外顯子的15個(gè)序列與牛的序列之間的差異較大，2個(gè)物種序列各聚為一類，沒有交叉出現(xiàn)。

圖3 MHCⅠ基因第二外顯子進(jìn)化樹Fig．3Phylogenetic analysis based on MHCⅠexon2

圖4 MHCⅠ基因第三外顯子進(jìn)化樹Fig．4Phylogenetic analysis based on MHCⅠ exon 3

3 討論

MHC基因區(qū)域的多態(tài)性已經(jīng)在很多脊椎動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)，并主要由自然選擇來維持［8］，由長期進(jìn)化過程中等位基因的積累，融合與擴(kuò)增形成，產(chǎn)生多態(tài)性的機(jī)制主要是突變和基因轉(zhuǎn)換［9］。綿羊MHCⅠ類分子在免疫反應(yīng)、疾病抵抗、易感性和發(fā)病過程［10］以及自身免疫方面都發(fā)揮著重要的作用，尤其是與動(dòng)物的抗病性和易感性存在著強(qiáng)相關(guān)關(guān)系［11］。不同品系綿羊抗病特征可能與其體內(nèi)與免疫反應(yīng)相關(guān)基因存在著密切關(guān)系，而用生物學(xué)的方法研究綿羊的MHC基因可以為綿羊的抗病育種提供科學(xué)依據(jù)［12］。對(duì)于綿羊MHC基因的多態(tài)性和與感染性疾病的抗性和易感性方面已經(jīng)有大量的研究：Li RY等［13］研究證明多浪羊、哈薩克羊和中國美利奴羊的MHC－DRB1基因第二外顯子多態(tài)性和棘球蚴病抗性之間存在關(guān)聯(lián)；Amaia Larruskain等［14］研究表明綿羊MHCII類DRBⅠ基因的多態(tài)性對(duì)于梅迪威斯納病和肺腺炎病毒病的病例進(jìn)程有影響；Stear等［15］研究表明綿羊MHC與線蟲的抗性有關(guān)聯(lián)；賈斌等［16］研究表明多浪羊和中國美利奴羊 MHCDRB1基因多態(tài)性與包蟲病的遺傳易感性相關(guān)。但是，目前對(duì)于綿羊MHC多態(tài)性的研究多集中在綿羊MHC II類基因，且大多數(shù)關(guān)于DRB基因座，對(duì)MHC I類多態(tài)性研究的較少，Keith等［17］對(duì)4個(gè)單體型的MHCⅠ類基因的基因組學(xué)和蛋白組學(xué)分析結(jié)果顯示，綿羊MHCI類基因可能最多含有8個(gè)基因座。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)新疆147團(tuán)的48只美利奴羊的MHCⅠ基因的第二、三外顯子的多態(tài)性進(jìn)行了分析，這些多態(tài)位點(diǎn)與MHCⅠ類分子與內(nèi)源性抗原的遞呈有關(guān)，從而與疾病的抗性相關(guān)聯(lián)；盡管羊MHCⅠ類基因之間的同源性較高，但是有時(shí)序列能與牛的序列成簇。這些成簇的牛和羊的序列說明它們可能在牛和羊分化前的共同祖先中就存在這樣的基因，也就是所謂的跨物種假設(shè)［18］；病原體的識(shí)別也為MHCⅠ類基因的進(jìn)化提供了選擇壓力，牛和羊具有相似的序列可能說明了針對(duì)共同的病原體的特定免疫反應(yīng)的存在［19］。本研究結(jié)果可為進(jìn)一步研究MHCⅠ類分子的多態(tài)性與疾病抗性之間的關(guān)系提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，也為抗原表位疫苗的研發(fā)做了前期工作。

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