何秋立，張 旭，王 娟，翟瑞萍，喬彩霞，孫霞霞，倪維華，高素君，臺(tái)桂香

（1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院腫瘤中心，吉林 長春 130021；2.吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，吉林 長春 130021）

肺癌是當(dāng)前世界各地發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，早期診斷對(duì)其預(yù)后有重要意義［1］。但是肺癌的早期診斷仍是臨床工作者面臨的難題，血清腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)為解決該難題提供了新的研究方向［2］。黏蛋白1（mucin 1，MUC1）是黏蛋白家族的重要成員，屬于跨膜糖蛋白。在腫瘤細(xì)胞中，細(xì)胞骨架破壞，導(dǎo)致其胞外段脫落形成血清MUC1。在乳腺癌、卵巢癌和肺癌等多種實(shí)體腫瘤及部分血液系統(tǒng)惡性腫瘤中，均存在MUC1的高表達(dá)，MUC1是一種非常有價(jià)值的腫瘤標(biāo)志物［3－4］，其中血清 MUC1作為檢測(cè)乳腺癌的腫瘤標(biāo)志物，對(duì)疾病診斷及預(yù)后有重要意義，已得到大量臨床資料［5－6］的證實(shí)。臨床上廣泛應(yīng)用 CA15－3試劑盒檢測(cè)血清MUC1表達(dá)水平，該試劑盒以單克隆抗體為包被抗體和檢測(cè)抗體，只針對(duì)某一免疫表位，針對(duì)肺癌的檢出率低［7－9］，在實(shí)驗(yàn)室前期制備兔抗人MUC1多克隆抗體的基礎(chǔ)上［10］，本文作者首次嘗試改善檢測(cè)抗體為多克隆抗體，建立一種新的檢測(cè)血清 MUC1的酶聯(lián)免疫吸附法（enzymelinked immunesorbent assay，ELISA）試劑盒，對(duì)48例肺癌患者的血清MUC1進(jìn)行檢測(cè)，并與臨床上常用的CA15－3試劑盒進(jìn)行比較，評(píng)估其在肺癌診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 肺癌組為48例肺癌患者，均為2011年2—5月于吉林大學(xué)第一醫(yī)院胸外科和腫瘤科的住院患者，經(jīng)術(shù)后病理確診。肺癌組患者年齡35～73歲，平均年齡59歲；其中男性28例，女性20例；腺癌26例，鱗癌15例，小細(xì)胞肺癌7例。肺良性疾病組為7例同期本院呼吸科住院患者，診斷為肺炎或肺結(jié)核；其中男性4例，女性3例，平均年齡60歲。健康對(duì)照組選取20例同期在本院體檢中心體檢合格的正常人群；其中男性12例，女性8例，平均年齡58歲。各組患者均經(jīng)吉林大學(xué)第一醫(yī)院倫理委員會(huì)允許并與實(shí)驗(yàn)參與者簽署知情同意書。

1.2 主要試劑和儀器 鼠抗人MUC1單克隆抗體GP1.4（美國Neo marker公司），MUC1標(biāo)準(zhǔn)品及兔抗人MUC1多克隆抗體（吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室提供），山羊抗兔IgG－HRP（美國Sigma公司）；CA15－3試劑盒（Roche公司），全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀（羅氏診斷公司）。

1.3 血清采集 收集研究對(duì)象的空腹靜脈血，肝素抗凝，室溫放置30min，4℃放置過夜，次日3000r·min－1離心20min。收集血清，放置－20℃保存。檢測(cè)前先放置4℃融化，然后置室溫平衡后使用。

1.4 雙抗體間接夾心ELISA方法的建立 應(yīng)用棋盤滴定法選擇包被抗體、檢測(cè)抗體、酶標(biāo)抗體的最佳工作濃度。以鼠抗人MUC1單克隆抗體為包被抗體，采用5個(gè)質(zhì)量濃度（0.02、0.10、0.20、0.40和1.00mg·L－1）包被酶標(biāo)板，2%BSA 封閉；加入倍比稀釋的 MUC1蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（0.5、1.0、 2.0、 4.0、 8.0、 16.0、 32.0 和64.0μg·L－1）；再以兔抗人MUC1多克隆抗體作為檢測(cè)抗體，抗體設(shè)5個(gè)稀釋濃度（20.0、15.0、10.0、5.0和2.5mg·L－1）；然后加入山羊抗兔HRP酶標(biāo)抗體，采用5個(gè)稀釋濃度（1∶2500、1∶5000、1∶10000、1∶20000和1∶40000）；加入底物OPD溶液顯色；2mol·L－1的H2SO4終止反應(yīng)，經(jīng)酶標(biāo)儀檢測(cè)在490nm波長處的吸光度（A）值。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果確立雙抗體夾心ELISA方法的最佳實(shí)驗(yàn)條件、敏感度及標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過繪制受試者工作特征曲線（receive operating characteristic curve，ROC）確定最佳cut－off值。ROC是反映敏感度和特異度連續(xù)變量的綜合指標(biāo)，通過構(gòu)圖法揭示敏感度和特異度的相互關(guān)系，其通過將連續(xù)變量設(shè)定出多個(gè)不同的臨界值，從而計(jì)算出一系列敏感度和特異度，再以敏感度為縱坐標(biāo)、假陽性率（1－特異度）為橫坐標(biāo)繪制出曲線，曲線下面積（area under curve，AUC），記為Az。Az＝0.5表示完全無價(jià)值的診斷，Az＝0.5～0.7表示診斷準(zhǔn)確性較低，Az＝0.7～0.9表示診斷準(zhǔn)確性中等，Az＝0.9～1.0表示診斷準(zhǔn)確性較高，Az＝1表示完全理想的診斷。cut－off值取自ROC上敏感度和特異度最佳平衡位點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的數(shù)值，從而使實(shí)驗(yàn)的敏感度和特異度均達(dá)到較高的水平，使誤診率和漏診率均處于較低水平。特異度＝真陰性／（假陽性＋真陰性），敏感度＝真陽性／（真陽性＋假陰性）。約登指數(shù)＝敏感度＋特異度－1，其表示篩選方法發(fā)現(xiàn)真正的患者與非患者的能力，指數(shù)越大說明效果越好，真實(shí)性越大。

1.5 血清MUC1的測(cè)定 應(yīng)用本研究建立的雙抗體間接夾心ELISA方法，按上述步驟，采用設(shè)置好的最佳實(shí)驗(yàn)條件檢測(cè)肺癌組、肺良性疾病組和健康對(duì)照組研究對(duì)象外周血清MUC1表達(dá)水平。同時(shí)，嚴(yán)格按照CA15－3試劑盒的說明書操作，應(yīng)用羅氏全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀檢測(cè)各組研究對(duì)象血清MUC1表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，各組血清MUC1蛋白表達(dá)水平為非正態(tài)分布數(shù)據(jù)，表示為中位數(shù)（P25，P75），總體比較采用非參數(shù)Kruskal－Wallis檢驗(yàn)，兩兩比較采用Mann Whitney檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 雙抗體間接夾心ELISA方法中各組分最佳反應(yīng)濃度及敏感度 通過棋盤滴定法對(duì)包被抗體、檢測(cè)抗體和酶標(biāo)抗體進(jìn)行不同的組合篩選，最后確定試劑盒各個(gè)組分最佳工作濃度為：包被抗體（GP1.4抗體）每孔 0.1μg；檢測(cè)抗體（兔抗人MUC1多克隆抗體）的工作濃度為15mg·L－1；酶標(biāo)抗體IgG－HRP最佳稀釋比例為1∶5000。MUC1標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為8個(gè)濃度：0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0和64.0μg·L－1。采用上述條件，采用本研究建立的雙抗體間接夾心ELISA方法對(duì)不同濃度的MUC1蛋白標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，敏感度最高為0.5μg·L－1。見圖1。

2.2 血清MUC1蛋白表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果 應(yīng)用建立的MUC1雙抗體間接夾心ELISA法，對(duì)48例肺癌患者、7例肺良性疾病患者和20例健康體檢者外周血清中MUC1蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。肺癌組血清 MUC1蛋白平均濃度為2.70（1.64，4.07）μg·L－1，肺良性疾病組血清MUC1蛋白平均濃度為1.21（0.94，1.33）μg·L－1，健康對(duì)照組血清 MUC1蛋白平均濃度為1.44（1.22，1.66）μg·L－1。肺癌患者血清MUC1蛋白表達(dá)水平明顯高于肺良性疾病組與健康對(duì)照組（P＜0.01）；肺良性疾病組與健康對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。應(yīng)用CA15－3試劑盒檢測(cè)血清MUC1蛋白水平：肺癌組患者血清MUC1蛋白平均濃度高于肺良性疾病組和健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表1。

圖1 雙抗體間接夾心ELISA法的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of double－antibody indirect sandwich ELISA

表1 間接夾心ELISA法與CA15－3試劑盒檢測(cè)各組血清MUC1蛋白表達(dá)水平Tab.1 The serum MUC1protein expression levels in various groups detected by indirect sandwich ELISA and CA15－3kit ［M（P25，P75）］

2.3 雙抗體間接夾心ELISA法確定血清 MUC1正常值 應(yīng)用本研究建立的ELISA試劑盒檢測(cè)肺癌組和非肺癌組患者的血清MUC1蛋白表達(dá)水平后，并應(yīng)用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，分別計(jì)算出所有截?cái)帱c(diǎn)的敏感度和假陽性率（1－特異度），確定cut－off值，得出肺癌患者與非肺癌組最佳cut－off值為1.98μg·L－1，Az＝0.87。

2.4 雙抗體間接夾心ELISA法與CA15－3試劑盒檢測(cè)結(jié)果比較 根據(jù)雙抗體間接夾心ELISA法的檢測(cè)結(jié)果和通過ROC曲線確定的cut－off值，再進(jìn)行進(jìn)一步分析。48例肺癌患者中有30例血清MUC1蛋白表達(dá)水平大于1.98μg·L－1，為陽性；20例健康對(duì)照及7例肺良性疾病患者均為陰性。應(yīng)用羅氏全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀檢測(cè)血清MUC1表達(dá)水平，根據(jù)CA15－3試劑盒說明書提供的cut－off值（25U·mL－1），48例肺癌患者中9例為陽性；20例健康對(duì)照及7例肺良性疾病患者均為陰性。本研究建立的ELISA試劑盒檢測(cè)肺癌血清 MUC1的敏感度為62.5%（30／48），特異度為100%（27／27），約登指數(shù)為0.6250；CA15－3試劑盒檢測(cè)肺癌的敏感度為18.75%（9／48），特異度為100%（27／27），約登指數(shù)為0.1875。

圖2 雙抗體間接夾心ELISA法檢測(cè)肺癌組與非肺癌組血清MUC1蛋白表達(dá)水平的ROCFig.2 The ROC of MUC1protein expression levels in lung cancer group and non－lung cancer group detected by doubleantibody indirect sandwich ELISA method

3 討 論

針對(duì)臨床上CA15－3試劑盒敏感度低的局限性，本文作者通過改善檢測(cè)抗體為多克隆抗體，成功建立了一種新的雙抗體間接夾心ELISA試劑盒，并對(duì)本院的肺癌患者、肺良性疾病患者及健康對(duì)照者血清MUC1蛋白水平進(jìn)行檢測(cè)，通過ROC確定最佳cut－off值，并將檢測(cè)結(jié)果與CA15－3試劑盒比較，本研究建立的試劑盒在保持特異度的同時(shí)，明顯提高了檢測(cè)肺癌的敏感度及真實(shí)性。多項(xiàng)臨床研究［7－9］用已經(jīng)商業(yè)化的ELISA方法、化學(xué)發(fā)光免疫法和電化學(xué)發(fā)光等不同方法檢測(cè)肺癌患者血清MUC1表達(dá)水平，其敏感度均在20%左右，均低于本研究建立的雙抗體間接夾心ELISA法。有研究［11］應(yīng)用放射免疫法檢測(cè)血清 CA15－3（MUC1）水平，其診斷肺癌的敏感度和特異度分別為62.68%和88.00%。但是ELISA仍存在高特異度、操作簡單和方便等優(yōu)勢(shì)。

本研究建立的雙抗體間接夾心ELISA方法在保持特異度的同時(shí)，也提高了敏感度，原因可能如下：目前，商業(yè)化試劑盒均選用單克隆抗體作為包被抗體和檢測(cè)抗體，由于不同腫瘤在不同個(gè)體中所暴露的MUC1抗原表位不同，單克隆抗體的應(yīng)用雖大大提高了識(shí)別抗原的特異度，但由于單克隆抗體的結(jié)合表位單一，因此可能漏診許多陽性病例。本文作者根據(jù)夾心ELISA的原理，將針對(duì)MUC1的一種單克隆抗體包被，加入待檢樣本，待測(cè)抗原與固相載體表面的抗體形成抗原抗體復(fù)合物，再次加入針對(duì)MUC1蛋白的一種多克隆抗體形成雙抗體夾心免疫復(fù)合物；然后加酶標(biāo)抗體。由于檢測(cè)抗體（二級(jí)抗體）為多克隆抗體，可與抗原多個(gè)表位結(jié)合，降低了漏檢率，在此基礎(chǔ)上又比商業(yè)化雙抗體夾心ELISA多加了一層抗體，放大倍數(shù)再次增高，因此大大提高了敏感度。而由于包被抗體仍是單克隆抗體，從而保證了該實(shí)驗(yàn)的特異度。

在建立合理檢測(cè)方案的同時(shí)把腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)作為一項(xiàng)常規(guī)的針對(duì)于高危人群的腫瘤篩查方法是一種趨勢(shì)［12］，只有這樣才能真正實(shí)現(xiàn)肺癌的早期發(fā)現(xiàn)、早期治療，有效提高患者的生存率。本研究建立的ELISA試劑盒與臨床上常用的CA15－3試劑盒比較，檢測(cè)肺癌的敏感度及真實(shí)性得到明顯提高，且特異度高，穩(wěn)定性好，操作簡單、快速，普及比較方便，有望用于惡性腫瘤的早期診斷和風(fēng)險(xiǎn)人群的腫瘤篩選檢查等。如果將其進(jìn)一步優(yōu)化，包被抗體和檢測(cè)抗體均采用多克隆抗體，并聯(lián)合檢測(cè)其他腫瘤標(biāo)志物，肺癌檢測(cè)的敏感度可能會(huì)得到進(jìn)一步提高。但是為了更好地驗(yàn)證該方法的可行性和優(yōu)越性，還需要擴(kuò)大研究樣本量，需要更多臨床資料的積累和大規(guī)模前瞻性研究。

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