周佳琦，盧佳睿，徐 花，韓 放，孫延波

（吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系，吉林 長(zhǎng)春 130021）

＊吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)七年制2008級(jí)

自抗菌素問世以來，各種感染性疾病所造成的多種急重癥的治療已不再是難題，然而，抗生素的不合理使用所引起的細(xì)菌耐藥性問題日益突出。細(xì)菌對(duì)氨基糖苷類抗菌素的耐藥是由于細(xì)菌產(chǎn)生氨基糖苷類修飾酶（aminoglycoside modifying enzyme，AME）以及氨基糖苷類藥物的作用靶位16SrRNA的基因突變［1］。2006年初，美國(guó)學(xué)者 Robicsek等［2］發(fā)現(xiàn)了不僅對(duì)氨基糖苷類藥物有修飾作用，而且對(duì)喹諾酮類藥物也有修飾作用的新氨基糖苷類修飾酶aac（6′）－Ⅰb－Cr型。國(guó)內(nèi)雖有對(duì) AME基因的研究［3－4］，但未見有關(guān)長(zhǎng)春地區(qū)的文獻(xiàn)報(bào)道。腸桿菌科細(xì)菌和某些非發(fā)酵革蘭陰性桿菌是造成醫(yī)院感染重要的致病菌［5－6］，因此，為了解本地區(qū)革蘭陰性桿菌中AME基因存在狀況，本文作者對(duì)從臨床分離的69株革蘭陰性桿菌進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)，并檢測(cè)了6種 AME 基因，即aac（3）－Ⅰ、aac（3）－Ⅱ、aac（6′）－Ⅰ b、aac（6′）－Ⅱ、ant（3"）－Ⅰ 和ant（2"）－Ⅰ。

1 材料與方法

1.1 菌株和藥品 69株革蘭陰性桿菌來自長(zhǎng)春地區(qū)部分醫(yī)院檢驗(yàn)科，包括大腸埃希菌（Escherichia coli）31株，鮑曼不動(dòng)桿菌（Acinetobacter baumannii）15株，肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）11株，陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）12株。上述菌株經(jīng)法國(guó)生物梅里埃公司VITEK－32全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)鑒定。阿米卡星由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，批號(hào)：130335－200204。慶大霉素由北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司提供，批號(hào)：1B310330。

1.2 藥敏試驗(yàn) 采用瓊脂稀釋法測(cè)定69株革蘭陰性桿菌對(duì)阿米卡星和慶大霉素的敏感性，在藥物濃度超過16mg·L－1時(shí)，細(xì)菌仍生長(zhǎng)判定為耐藥，介于2～8mg·L－1為中介，低于2mg·L－1為敏感。

1.3 細(xì)菌處理 取菌液1mL置于1.5mL離心管，10000r·min－1離心1min，棄上清加入100μL TE Buffer（1mol·L－1Tris－HCl pH 8.0，500mmol·L－1EDTA pH 8.0），加入等體積酚／氯仿／異戊醇（25∶24∶1），渦旋震蕩 30s，10000r·min－1離心5min，上清液即為基因檢測(cè)的模板，－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 AME基因的引物設(shè)計(jì)及檢測(cè) 根據(jù)GenBank發(fā)布的各型AME基因序列自行設(shè)計(jì)引物，6種靶基因引物序列和產(chǎn)物長(zhǎng)度見表1。聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增體系：P1、P2引物各1μL（0.4μmol·L－1），Premix Taq 13μL（Taq DNA poL 1.25U·25μL－1，dNTPs 0.4mmol·L－1，PCR buffer），ddH2O 9μL，模板1μL，反應(yīng)體系25μL。PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度＞500bp的PCR反應(yīng)條件：93℃ 初始變性2min；93℃ 變性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min；35個(gè)循環(huán)，72℃最后延伸5min。PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度＜500bp的PCR反應(yīng)條件：93℃初始變性5min；93℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min；35個(gè)循環(huán)，72℃最后延伸5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2% 瓊脂糖凝膠電泳后，用凝膠成像儀觀察結(jié)果。

1.5 PCR產(chǎn)物測(cè)序 PCR產(chǎn)物送至北京六合華大基因科技股份有限公司測(cè)序，利用Chromas讀序軟件將測(cè)得序列與GenBank發(fā)布的序列進(jìn)行比對(duì)。

2 結(jié) 果

2.1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 69株革蘭陰性桿菌中有16株大腸埃希菌、1株肺炎克雷伯菌、3株陰溝腸桿菌和11株鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)阿米卡星呈現(xiàn)耐藥，即最低抑菌濃度超過16mg·L－1（表2）。慶大霉素的耐藥試驗(yàn)顯示：26株大腸埃希菌、11株肺炎克雷伯菌、8株陰溝腸桿菌和15株鮑曼不動(dòng)桿菌呈現(xiàn)耐藥（表3）。

2.2 AME基因檢測(cè)結(jié)果 在69株革蘭陰性桿菌中檢 出 aac（3）－Ⅰ、aac（3）－Ⅱ、aac（6′）－Ⅰb、ant（3"）－Ⅰ和ant（2"）－Ⅰ基因，其陽性株數(shù)分別為3（4.3%）、56（81.2%）、30（43.5%）、23（33.3%）和9（13.0%），而aac（6′）－Ⅱ基因?yàn)殛幮裕ū?）。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)：1株鮑曼不動(dòng)桿菌同時(shí)攜帶4種AME基因，15株細(xì)菌（5株鮑曼不動(dòng)桿菌、3株陰溝腸桿菌、5株大腸埃希菌和2株肺炎克雷伯菌）同時(shí)攜帶3種基因，25株（5株鮑曼不動(dòng)桿菌、3株陰溝腸桿菌、11株大腸埃希菌和6株肺炎克雷伯菌）同時(shí)攜帶2種基因（表5）。22株細(xì)菌僅1種基因陽性，其余6株未檢出任何1種基因。5種AME基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖1。

表3 革蘭陰性桿菌對(duì)慶大霉素的藥敏率Tab.3 The susceptibilities of gram－negative bacilli to gentamicin ［n（η／%）］

2.3 AME基因序列分析 5種AME基因測(cè)序結(jié)果見圖2～6。測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫比對(duì)，序列完全一致。

表4 AME基因檢測(cè)結(jié)果Tab.4 The detection results of AME gene ［n（η／%）］

表5 AME基因組合形式Tab.5 The combination form of AME gene

3 討 論

氨基糖苷類抗生素（aminoglycosides）是由氨基糖與氨基環(huán)醇連接而成的氨基糖苷類抗生素，可來自鏈霉菌的鏈霉素和小單孢菌的慶大霉素等天然氨基糖苷類。氨基糖苷類抗生素通過與細(xì)菌核糖體30S亞基的16SrRNA的A位解碼區(qū)核苷酸形成氫鍵，干擾細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成，從而發(fā)揮抗菌作用。

圖2 aac（3）－Ⅰ基因測(cè)序圖Fig.2 Sequencing diagram of aac（3）－Ⅰ gene

圖3 aac（3）－Ⅱ基因測(cè)序圖Fig.3 Sequencing diagram of aac（3）－Ⅱ gene

自1944年首次發(fā)現(xiàn)鏈霉素以來，因此類藥物抗菌譜廣、療效卓越，在醫(yī)學(xué)臨床和畜牧獸醫(yī)業(yè)得到廣泛應(yīng)用。但由于逐年泛用和過度使用，各種細(xì)菌對(duì)氨基糖苷類抗菌素耐藥問題也日益嚴(yán)重，細(xì)菌對(duì)該類抗生素耐藥可通過酶修飾、細(xì)胞膜滲透性改變、外排泵活性、phoP－phoQ系統(tǒng)和16SrRNA甲基化酶等機(jī)制［5－7］來實(shí)現(xiàn)。在所有機(jī)制中，質(zhì)?；蛉旧w介導(dǎo)的AME是最普遍的。AME由質(zhì)粒或染色體編碼，通常由可移動(dòng)DNA片段攜帶，質(zhì)粒的交換和轉(zhuǎn)座子作用均有利于耐藥基因滲入到敏感菌株［8］。這些修飾酶包括乙酰轉(zhuǎn)移酶（AAC）、磷酸轉(zhuǎn)移酶（APH）和核苷轉(zhuǎn)移酶（ANT）3類［9－11］。目前已發(fā)現(xiàn)的編碼AME的基因已有30余種，在革蘭陰性桿菌中常見的有10種，除本文作者檢測(cè)的6種外，還有aac（3）－Ⅲ、aac（3）－Ⅳ、aac（6′）－Ⅰ和aph（3′）－Ⅵ［12］。這些耐藥基因經(jīng)常借助可移動(dòng)性元件如質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子和整合子等在同種或不同種細(xì)菌間傳播［13－14］。

圖4 aac（6′）－Ⅰ b基因測(cè)序圖Fig.4 Sequencing diagram of aac（6′）－Ⅰ b gene

圖5 ant（3"）－Ⅰ基因測(cè)序圖Fig.5 Sequencing diagram of ant（3"）－Ⅰ gene

圖6 ant（2"）－Ⅰ基因測(cè)序圖Fig.6 Sequencing diagram of ant（2"）－Ⅰ gene

本研究分離的革蘭陰性桿菌對(duì)阿米卡星與慶大霉素的耐藥率分別為44.9%和87.0%，除肺炎克雷伯菌與陰溝桿菌對(duì)阿米卡星耐藥率稍低（9.1%、25.0%），余者對(duì)這2種抗生素的耐藥率均高于50%，說明革蘭陰性桿菌對(duì)氨基糖苷類抗生素耐藥率已經(jīng)很高。在69株細(xì)菌中有63株檢測(cè)出AME基因，占91.3%，說明革蘭陰性桿菌攜帶氨基糖苷類耐藥基因較為嚴(yán)重，與耐藥表型相符。本研究中AME基因陽性率較高并居前3位的分別為aac（3）－Ⅱ（81.2%）、aac（6′）－Ⅰ b（43.5%）和ant（3"）－Ⅰ（33.3%）；有41 株 （59.4%）的菌株攜帶2種及以上的修飾酶基因，多種耐藥基因的組合在細(xì)菌對(duì)氨基糖苷類抗生素耐藥機(jī)制中發(fā)揮了重要作用。攜帶2種及以上的修飾酶基因中也是aac（3）－Ⅱ比例最高，這種修飾酶基因的存在顯然與菌株對(duì)氨基糖苷類抗生素的高水平耐藥密切相關(guān)。9株敏感菌株中2株檢測(cè)出ant（2"）－Ⅰ，1株檢測(cè)出aac（3）－Ⅱ，原因可能是與AME基因表達(dá)強(qiáng)弱或者無表達(dá)有關(guān)，耐藥基因盒的表達(dá)不僅依賴于啟動(dòng)子的強(qiáng)弱，而且與啟動(dòng)子的距離遠(yuǎn)近有關(guān)；上游基因表達(dá)強(qiáng)，下游基因表達(dá)弱甚至可能不表達(dá)［15］，有待進(jìn)一步研究。同時(shí)，攜帶aac基因盒和碳青霉烯酶的整合子將會(huì)使細(xì)菌耐藥問題越來越嚴(yán)重［16－17］，本研究中檢出率最高的是aac（3）－Ⅱ基因，值得高度關(guān)注?？股胤河煤蜑E用是導(dǎo)致相關(guān)耐藥基因傳播的重要原因，因此臨床上要注意合理使用抗生素。

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