吳 俊，姚 平，高 超

(1.中國人民解放軍軍事經(jīng)濟學院營養(yǎng)食品研究所，湖北 武漢 430035；2.華中科技大學同濟醫(yī)學院公共衛(wèi)生學院營養(yǎng)與衛(wèi)生學系，湖北 武漢 430030)

原花青素(proanthocyanidins，PC)屬于植物來源的聚多酚類化合物，是由兒茶素、表兒茶素及表兒茶素沒食子酸酯通過C4—C6或 C4—C8縮合而成的不同聚合度的混合物，廣泛存在于葡萄、山楂、蘋果、草莓、藍莓、紫薯、可可豆、油菜籽、蓮等多種植物中，為植物的次生代謝產(chǎn)物[1-3]。國內(nèi)外大量研究表明，原花青素具有抗氧化、清除自由基、抗皮膚過敏、擴張血管、免疫調(diào)節(jié)、預防心血管疾病等多項生理功能，在食品、藥品、化妝品等領域的研究價值日益受到關(guān)注。目前，對原花青素的開發(fā)已擴展到多個植物品種，其中包括蓮科藥用植物——蓮。蓮在我國是一種分布非常廣泛的天然植物資源，具有很高的食用與藥用價值。近年來的研究顯示，蓮的成熟花托(蓮房)中含有豐富的蓮房原花青素(lotus seedpod proanthocyanidins，LSPC)，其分子聚合度低，生物利用率高，在清除自由基、抗脂質(zhì)過氧化、抑制心血管疾病等方面均表現(xiàn)出顯著的生理活性[4-6]?；诖?，本研究采取乙醇浸提，柱層析純化法提取蓮房原花青素，建立小鼠大強度運動訓練模型，通過灌服不同劑量蓮房原花青素，測試與分析小鼠在大強度力竭性運動條件下的生理生化指標和組織器官變化，探討蓮房原花青素對大強度運動訓練動物機體的保護作用，為拓展蓮房原花青素在軍事體能訓練與體育競技運動保健食品方面的應用研究提供理論及實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選擇產(chǎn)自湖北省洪湖地區(qū)當年生新鮮去籽蓮房，清水洗滌后經(jīng)石油醚脫脂，低溫干燥、粉碎，加入一定量體積分數(shù)為75%的乙醇溶液，于60℃條件下振蕩、浸提90min，減壓蒸餾去除浸提液中的乙醇，過濾，將濾液經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱層析分離純化后冷凍干燥，得淺黃色蓮房原花青素提取物[6-8]。以兒茶素為對照品，采用硫酸-香草醛法[9]測定提取物中原花青素含量大于98%，計算得率為3.06%。

BALB/c ICRC57清潔級雄性成年小鼠，體質(zhì)量(18±1)g 上海西普爾-必凱實驗動物有限公司。

血清尿素氮(BUN)、肌酐(Cre)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)、乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)試劑盒 北京中生北控生物科技股份有限公司；乳酸(LA)、肝糖原、肌糖原試劑盒 深圳麥瑞生物醫(yī)療電子有限公司；石油醚、乙醇均為分析純。

1.2 儀器與設備

SpectraMax M2全能酶聯(lián)儀 美國Molecular Devices公司；BS-200全自動生化分析儀 美國貝克曼庫爾特公司；Hemastar 3血球計數(shù)儀 法國Yoder公司。

1.3 方法

將BALB/c ICRC57清潔級雄性成年小鼠，隨機分為5組，每組10只。具體分組如下：A.安靜對照組；B.運動對照組；C. LSPC低劑量運動組(20mg/(kg·d))；D. LSPC中劑量運動組(50mg/(kg·d))；E. LSPC高劑量運動組(100mg/(kg·d))。

各組小鼠經(jīng)口灌胃給予不同劑量的蓮房原花青素或?qū)φ瘴?蒸餾水)，連續(xù)30d。在灌胃的第20天起，各運動組小鼠先進行3d的適應性跑臺運動，休息2d后，開始正式大強度力竭性運動。每次運動初始速率為10m/min，在10min內(nèi)逐漸增加負荷達到28m/min速率，以弱電刺激小鼠持續(xù)跑動60min，每天1次，至第5天運動結(jié)束，立即處死各運動組小鼠，采血，解剖分離心、肝、腎和股四頭肌，作生化檢測與病理分析[10-12]。

1.4 指標測定

血液學指標：采血，EDTAK2抗凝后利用全自動生化分析儀測定血紅蛋白(Hb)，利用血球計數(shù)儀計數(shù)紅細胞(RBC)、白細胞(WBC)及其分類(淋巴細胞、單核細胞)。

BUN、Cre、GPT、GOT、LDH、CK活力：采用酶動力學法測定；BUN、Cre含量：采用兩點法測定；肝糖原、肌糖原、LA水平：采用酶法測定；SOD水平：采用黃嘌呤氧化酶法測定；GSH水平：采用二硫代二硝基苯甲酸(DNTB)比色法測定；MDA水平：采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法測定。上述指標均嚴格按照試劑盒說明程序進行。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

實驗數(shù)據(jù)采用SAS軟件進行方差分析與Q檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 LSPC對大強度運動小鼠血液學指標的影響

表 1 LSPC對大強度運動小鼠血液學指標的影響(±s，n=10)Table 1 Effect of LSPC on blood indexes in mice with high intensity exercise(±s，n=10)

表 1 LSPC對大強度運動小鼠血液學指標的影響(±s，n=10)Table 1 Effect of LSPC on blood indexes in mice with high intensity exercise(±s，n=10)

注：*.與A 組相比，有顯著性差異(P ＜0.05)；**.與A 組相比，有極顯著性差異(P ＜0.01)；Δ.與B 組相比，有顯著性差異(P ＜0.05)；ΔΔ.與B 組相比，有極顯著性差異(P ＜0.01)。下同。

WBC分類/(109/L)淋巴 單核A2.18±0.26115.8±9.43.02±0.452.95±0.390.07±0.08 B1.67±0.19**79.5±6.3**5.87±1.22**5.66±1.09**0.21±0.18 C2.05±0.32Δ83.7±7.5**4.59±1.02**Δ 4.43±0.95**Δ0.16±0.15 D1.82±0.20** 94.6±10.2**ΔΔ 4.23±1.17*ΔΔ 4.07±1.01*ΔΔ0.16±0.18 E2.18±0.27ΔΔ89.7±8.1**Δ4.90±0.85**4.71±0.94**0.18±0.08組別RBC/(1012/L)Hb/(g/L)WBC/(109/L)

大強度運動條件下機體活性自由基生成量增多，攻擊細胞器及亞細胞器，成為造成機體組織出現(xiàn)運動性炎癥反應的重要原因，甚至引發(fā)一系列病理損傷[13-14]。由表1可見，經(jīng)過大強度力竭性運動，與A組小鼠相比，B組小鼠的RBC與Hb水平極顯著下降，WBC與淋巴細胞計數(shù)極顯著升高，說明大強度運動訓練已致小鼠免疫功能下降，出現(xiàn)炎癥反應。當預先給予不同劑量的蓮房原花青素后，小鼠的上述指標均有不同程度的恢復，且中等劑量組干預效果明顯，這主要與蓮房原花青素具有較強的清除自由基活性直接相關(guān)。

2.2 LSPC對大強度運動小鼠血清生化指標的影響

由表2可見，B組小鼠的血清GPT、GOT明顯升高，反映大強度力竭性運動后小鼠肝細胞受到損傷；BUN、Cre水平的升高則提示腎臟受到不良影響；過度運動導致骨骼肌中的CK和臟器細胞胞漿中的LDH大量滲出，從而使血清中CK與LDH水平極顯著升高，提示臟器及骨骼肌受損；血糖是機體能量的重要來源，大強度力竭性運動條件下小鼠出現(xiàn)能量代謝障礙，細胞無氧代謝強度增加，致使血糖水平下降，而血液中LA水平明顯增高，將加速運動性疲勞產(chǎn)生。經(jīng)不同劑量的蓮房原花青素干預后，小鼠上述血清指標均有不同程度的改善，尤其以中、高劑量組干預效果顯著。

表 2 LSPC對大強度運動小鼠血清生化指標的影響(±s，n=10)Table 2 Effect of LSPC on serum biochemical indexes in mice with high intensity exercise(±s，n=10)

表 2 LSPC對大強度運動小鼠血清生化指標的影響(±s，n=10)Table 2 Effect of LSPC on serum biochemical indexes in mice with high intensity exercise(±s，n=10)

組別 GPT活力/(U/L) GOT活力/(U/L) BUN含量/(mmol/L) Cre含量/(μmol/L) Glu含量/(mmol/L) LA含量/(mmol/L) LDH活力/(1000U/L) CK活力/(U/L)A47.2±5.4113±154.48±0.6038.9±5.15.53±0.664.22±0.581.83±0.31354±41 B63.1±7.6**179±21**7.89±1.01**47.6±6.3**3.11±0.37**6.38±1.03**3.09±0.51**822±114**C59.7±7.6**144±19**ΔΔ6.92±1.35**44.8±5.7*3.44±0.50**6.00±0.92**2.88±0.46**772±98**D51.7±8.9ΔΔ149±22**ΔΔ5.83±0.72**ΔΔ38.4±7.0Δ3.95±0.54**ΔΔ5.87±0.70**2.24±0.50ΔΔ686±83**Δ E54.8±6.3*Δ156±27**6.07±0.85**ΔΔ41.6±8.93.38±0.54**5.75±0.88**2.49±0.43**Δ759±95**

2.3 LSPC對大強度運動小鼠肌肉及臟器的影響

解剖各組小鼠，取股四頭肌、心肌、肝臟、腎臟，勻漿后測定超氧化物歧化酶(SOD)活性、谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)含量，測定肝糖原和肌糖原的質(zhì)量分數(shù)，結(jié)果如表3所示。

表 3 LSPC對大強度運動小鼠臟器氧化應激保護作用及肝、肌糖原水平的影響(±s，n=10)Table 3 Effect of LSPC on the protection of oxidative stress-induced organ damage, and the contents of hepatic glycogen and muscle glycogen in mice with high intensity exercise(±s，n=10)

表 3 LSPC對大強度運動小鼠臟器氧化應激保護作用及肝、肌糖原水平的影響(±s，n=10)Table 3 Effect of LSPC on the protection of oxidative stress-induced organ damage, and the contents of hepatic glycogen and muscle glycogen in mice with high intensity exercise(±s，n=10)

注：—. 該項指標未進行測定。

組織 組別SOD活力/(U/mg pro)GSH含量/(nmol/mg pro)MDA含量/(nmol/mg pro)糖原含量/%股四頭肌A13.8±1.51.67±0.254.87±0.531.26±0.19 B9.4±1.1**1.15±0.12**7.95±1.05**0.68±0.16**C10.9±1.1**Δ1.37±0.21*Δ6.32±0.90**ΔΔ0.78±0.19**D11.5±1.4**ΔΔ 1.42±0.18*ΔΔ6.09±1.04**ΔΔ0.90±0.16**Δ E11.7±1.0**ΔΔ 1.59±0.24ΔΔ7.13±1.29**0.74±0.21**心肌A31.8±2.92.51±0.244.58±0.62—B22.4±2.6**1.73±0.19**8.71±0.99**—C25.6±1.9**Δ2.16±0.25*ΔΔ6.14±0.82**ΔΔ —D24.3±2.8**2.25±0.21*ΔΔ6.02±0.65**ΔΔ —E25.7±2.5**Δ1.84±0.27**7.87±1.28**—肝臟A43.8±3.72.81±0.237.36±0.911.91±0.28 B31.9±4.5**1.90±0.20**11.88±1.67**1.09±0.17**C32.7±3.8**2.26±0.25**ΔΔ10.25±1.82**1.26±0.24**D38.4±5.1**Δ2.39±0.31**ΔΔ9.38±1.36**ΔΔ1.38±0.24**Δ E34.3±4.7**2.08±0.26**9.94±1.49**Δ1.26±0.27**A27.6±2.41.95±0.235.88±0.81—B19.0±2.0**1.16±0.24**9.03±1.22**—C23.8±1.6**ΔΔ 1.34±0.17**8.09±0.97**—D26.9±3.0ΔΔ1.78±0.22ΔΔ7.47±0.91**ΔΔ —E24.8±2.5*ΔΔ 1.49±0.30**Δ8.36±0.67**—腎臟

肝臟與腎臟通常是大強度運動訓練過程中臟器損傷的主要靶器官，心肌組織與骨骼肌也是過度運動的易損部位[14-15]。由表3可見，在大強度力竭性運動的強氧化應激作用下，小鼠機體抗自由基損傷能力受到干擾，大量自由基持續(xù)攻擊生物膜引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用，導致小鼠股四頭肌、心肌、肝臟、腎臟中SOD活力顯著下降，MDA水平明顯升高。同時，GSH與肝糖原大量消耗，提示大強度力竭性運動導致機體免疫功能及能量代謝過程受到影響。給予不同劑量的蓮房原花青素，上述各指標均有不同程度的恢復，尤其以中劑量干預效果明顯，說明蓮房原花青素對大強度力竭性運動引起的臟器組織氧化應激具有明顯的保護作用，并可在一定程度上維持肝糖原和肌糖原的正常水平，從而有效降低過度運動所致的疲勞損傷，提高運動訓練效果。

2.4 LSPC對大強度運動小鼠骨骼肌與心肌病理變化的影響

圖 1 各組實驗小鼠骨骼肌切片F(xiàn)ig.1 Skeletal muscle sections of the mice from each group

圖 2 各組實驗小鼠心肌切片F(xiàn)ig.2 Cardiac muscle sections of the mice from each group

由圖1可知，運動對照組小鼠的骨骼肌纖維呈現(xiàn)廣泛腫脹，形態(tài)扭曲或斷裂，有肌溶解現(xiàn)象，肌核分布不勻，甚至局部出現(xiàn)核聚集[16]。而給予蓮房原花青素的運動組小鼠，其骨骼肌仍保持了較為規(guī)則的細胞結(jié)構(gòu)，只呈現(xiàn)出輕微腫脹。由圖2可知，運動對照組小鼠心肌纖維廣泛扭曲、斷裂，出現(xiàn)肌溶解與間質(zhì)出血，心肌灶性壞死，而灌服蓮房原花青素的運動組小鼠，其心肌纖維雖然存在局部扭曲或斷裂，但與運動對照組相比，肌纖維排列較規(guī)則，異常表現(xiàn)輕微。圖1、2表明，蓮房原花青素對大強度運動訓練條件下小鼠的骨骼肌與心肌具有一定的保護作用。

3 結(jié) 論

利用蓮房原花青素在清除自由基以及抗脂質(zhì)過氧化方面所表現(xiàn)出的生理活性，能夠有效緩解大強度力竭性運動訓練對小鼠臟器及組織細胞的不良影響，并通過降低毛細血管通透性，減少毛細血管壁的脆性，以減輕大強度運動所致的機體炎癥反應；蓮房原花青能夠促進無氧代謝條件下血乳酸的清除，降低大強度運動訓練導致的強氧化應激損傷，對骨骼肌、心臟、肝臟及腎臟均表現(xiàn)出明顯的保護作用，并呈現(xiàn)出一定的劑量性依賴關(guān)系。綜上所述，蓮房原花青素在緩解大強度運動性疲勞，預防過度訓練所致機體損傷等方面具有明顯的生理功能性作用。

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