陳紅梅，謝 翎，2

（1.安慶師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，安徽安慶 246011；2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物防治省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽合肥230036）

蓮（Nelumbium nuciferum）為睡蓮科多年生草本植物，因具有可口的風(fēng)味和較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，深受人們喜愛(ài)，在我國(guó)廣泛種植。蓮有多個(gè)部位可以入藥，包括荷花、荷葉、蓮子、蓮房、藕等，且藥用價(jià)值不同[1-2]。蓮房是蓮的干燥成熟花托，又名蓮蓬殼（lotus seed pod，LS），體輕，質(zhì)疏松，味苦澀，歸肝經(jīng)，具有消瘀、止血、袪濕等功效[3]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，蓮房中富含多種化學(xué)成分，其中包括槲皮素、金絲桃苷、槲皮素-3-二葡萄糖苷等黃酮類(lèi)化合物[4]。黃酮類(lèi)化合物具有抗氧化、抗腫瘤、抗輻射、降血脂等作用[5]，已被廣泛應(yīng)用于食品、衛(wèi)生及化妝品行業(yè)中。目前對(duì)蓮房多酚類(lèi)物質(zhì)研究較多，而對(duì)黃酮類(lèi)化合物的研究卻很少。蓮房作為蓮的非可食部分，一般采摘于立夏后，除少數(shù)被民間作為食物香料使用外，大部分均作為廢棄物而被直接丟棄，不僅造成了極大的浪費(fèi)，蓮房較大的體積堆積在一起也對(duì)環(huán)境造成了嚴(yán)重的污染。提取黃酮類(lèi)化合物最常用的方法有有機(jī)溶劑提取法、超聲波輔助提取法和微波輔助提取法等，而用微波輔助提取蓮房黃酮的文章幾乎未見(jiàn)報(bào)道。本研究采用微波輔助提取法對(duì)蓮房黃酮進(jìn)行提取，并結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)篩選出最佳的工藝條件。同時(shí)通過(guò)對(duì)蓮房黃酮提取物的還原力、DPPH自由基清除率及羥基自由基清除率的測(cè)定，對(duì)蓮房黃酮提取物抗氧化活性進(jìn)行測(cè)定[6]，以期為蓮房的綜合利用提供理論依據(jù)，也為天然抗氧化劑的開(kāi)發(fā)提供新的資源。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蓮房 購(gòu)于農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 上海生化制品廠；1，1-二苯基苦基苯肼（DPPH） Sigma公司；硝酸鋁、亞硝酸鈉、無(wú)水乙醇、氫氧化鈉、鐵氰化鉀、三氯化鐵 均為分析純。

UV-2000型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海尤尼柯公司；FA2004A型電子天平 上海精天電子儀器有限公司；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國(guó)華電器有限公司；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；FW-100型高速粉碎機(jī) 上海楚定分析儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作 準(zhǔn)確稱(chēng)取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品20mg，置于50mL容量瓶中，用70%乙醇溶解并定容，得到質(zhì)量濃度為0.4mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密吸取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL標(biāo)準(zhǔn)溶液置于25mL容量瓶中，用70%乙醇補(bǔ)充至10mL，各加入5%的NaNO2溶液2mL，混勻，放置6min，再加入10%Al（NO3）3溶液2mL，混勻，放置6min，再各加入4%的NaOH溶液2mL，用70%乙醇定容至刻度，混勻，放置15min，在波長(zhǎng)510nm處測(cè)定吸光度。以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度（C：mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)，得到回歸方程：A=0.2845C-0.2811，R2=0.9995。

1.2.2 蓮房黃酮提取工藝及含量測(cè)定 準(zhǔn)確稱(chēng)取蓮房粉末5.0g放入磨口三角燒瓶中，加入一定體積一定濃度的乙醇溶液，在一定溫度下回流提取一定時(shí)間，過(guò)濾，濾渣用石油醚脫色2次后再次過(guò)濾，所得濾渣用70%乙醇溶解并定容至50mL，作為待測(cè)液，按1.2.1進(jìn)行操作，測(cè)定黃酮含量。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 稱(chēng)取一定量的蓮房粉末，以黃酮得率為考察指標(biāo)，分別研究不同乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間和微波功率對(duì)蓮房黃酮得率的影響。

1.2.3.1 乙醇濃度對(duì)浸提效果的影響 稱(chēng)取烘干至恒重的蓮房粉末5.0g，按料液比1∶10的比例分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液，在微波功率200W的條件下，提取80s，研究不同乙醇濃度對(duì)蓮房黃酮得率的影響。

1.2.3.2 料液比對(duì)浸提效果的影響 稱(chēng)取烘干至恒重的蓮房粉末5.0g，分別按料液比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25的比例加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液，在微波功率200W的條件下，提取80s，研究不同料液比對(duì)蓮房黃酮得率的影響。

1.2.3.3 提取時(shí)間對(duì)浸提效果的影響 稱(chēng)取烘干至恒重的蓮房粉末5.0g，按料液比1∶15的比例加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液，在微波功率200W的條件下，分別提取20、40、60、80、100、120、140s，研究不同提取時(shí)間對(duì)蓮房黃酮得率的影響。

1.2.3.4 微波功率對(duì)浸提效果的影響 稱(chēng)取烘干至恒重的蓮房粉末5.0g，按料液比1∶15的比例加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液，分別在微波功率100、200、300、400、500、600W的條件下，提取100s，研究不同微波功率對(duì)蓮房黃酮得率的影響。

1.2.4 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間和提取溫度四個(gè)因素，以蓮房黃酮得率為指標(biāo)，進(jìn)行L9（34）正交實(shí)驗(yàn)，因素水平見(jiàn)表1。

表1L9（34）正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1Factors and levels of L9（34）orthogonal design

1.2.5 蓮房黃酮提取物抗氧化性能測(cè)定

1.2.5.1 還原力的測(cè)定[7-8]分別配制0.05、0.1、0.2、0.3、0.4mg/mL質(zhì)量濃度的樣品溶液，取1.0mL樣品溶液置于試管中，再加入pH6.6的磷酸鹽緩沖溶液1.5mL和1%鐵氰化鉀溶液1.5mL，充分混勻，置于50℃恒溫水浴鍋中保溫30min，冷卻后加入三氯乙酸1mL，充分振蕩后，于4500r/min下離心10min。取上清液1mL加入1mL 0.1%FeCl3溶液和2mL蒸餾水混勻，靜置10min，在波長(zhǎng)700nm處測(cè)定其吸光度值，以蒸餾水為空白。吸光度值越大，樣品的還原力越強(qiáng)。另以VC作陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.5.2 DPPH自由基清除率[9-10]的測(cè)定 分別配制0.05、0.1、0.2、0.3、0.4mg/mL質(zhì)量濃度的樣品溶液，取0.3mL樣品溶液同2.7mL 0.1mmol/L的DPPH甲醇溶液充分混勻，在室溫下反應(yīng)2h后在517nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，未加入樣品的DPPH甲醇溶液為空白。同時(shí)，以VC和BHT作陽(yáng)性對(duì)照。樣液對(duì)DPPH自由基的清除率按式（1）計(jì)算。

式中：A0為空白吸光度值；A1為樣品溶液吸光度值。

1.2.5.3 羥基自由基（·OH）清除率[11-12]的測(cè)定 分別配制0.05、0.1、0.2、0.3、0.4mg/mL質(zhì)量濃度的樣品溶液，吸取1.0mL置于試管中，加入1.0mL 5mmol/L的水楊酸溶液和1.0mL 5mmol/L的FeSO4溶液，再加入2.0mL蒸餾水，充分混勻后加入1.0mL 5mmol/L的H2O2，在37℃水浴中恒溫反應(yīng)30min后，于510nm處測(cè)定其吸光度值，以蒸餾水作空白，同時(shí)以VC作陽(yáng)性對(duì)照。樣液對(duì)羥基自由基（·OH）的清除率按式（2）計(jì)算。

式中：A0為空白吸光度值；A2為加入黃酮溶液后的吸光度值；A1為不加H2O2的黃酮溶液吸光度值。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 乙醇濃度對(duì)蓮房黃酮得率的影響 結(jié)果見(jiàn)圖1，由圖1可以看出，隨著乙醇濃度的增加，蓮房黃酮得率也在增加。在乙醇濃度為70%時(shí)，黃酮得率達(dá)到最大。進(jìn)一步增加乙醇濃度，黃酮得率反而下降。這主要是因?yàn)?，隨著乙醇濃度的增加，也增加了一些脂溶性物質(zhì)的溶出度，影響了蓮房黃酮得率。所以，選擇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液作為提取溶劑。

圖1 乙醇濃度對(duì)黃酮得率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on flavonoid yield

2.1.2 料液比對(duì)蓮房黃酮得率的影響 結(jié)果見(jiàn)圖2，由圖2可以看出，隨著料液比的減小，蓮房黃酮得率也在逐漸增加，但當(dāng)料液比達(dá)到1∶20時(shí)，繼續(xù)減小料液比，蓮房黃酮得率增加緩慢?？紤]到成本和后續(xù)操作，選擇料液比為1∶15比較合適。

圖2 料液比對(duì)黃酮得率的影響Fig.2 Effect of material-solvent ratio on flavonoid yield

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)蓮房黃酮得率的影響 結(jié)果見(jiàn)圖3，由圖3可以看出，提取時(shí)間在由20s上升到80s這段區(qū)間，蓮房黃酮得率上升也比較快；提取時(shí)間進(jìn)一步升高后，黃酮得率也在增加，但增加的速率很緩慢，達(dá)到120s時(shí)，黃酮得率幾乎不再增加，這主要是因?yàn)樘崛r(shí)間達(dá)到一定值后，蓮房黃酮提取物已基本全部溶出，因此選擇提取時(shí)間為100s。

圖3 提取時(shí)間對(duì)黃酮得率的影響Fig.3 Effect of extraction time on flavonoid yield

2.1.4 微波功率對(duì)蓮房黃酮得率的影響 結(jié)果見(jiàn)圖4，由圖4可以看出，當(dāng)微波功率逐漸升高時(shí)，黃酮得率也呈增加趨勢(shì)；當(dāng)微波功率達(dá)到400W后再增加功率，黃酮得率呈緩慢下降趨勢(shì)。這主要是因?yàn)?，隨著微波功率的升高，使得溫度也升高，黃酮分子運(yùn)動(dòng)加速，能較快的從細(xì)胞轉(zhuǎn)移至溶液中；但如果微波功率過(guò)高，也使得雜質(zhì)的溶出量增多，影響黃酮的得率。

圖4 微波功率對(duì)黃酮得率的影響Fig.4 Effect of microwave power on flavonoid yield

2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

為綜合考慮各因素相互作用對(duì)蓮房黃酮得率的影響，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行四因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表2所示。由極差分析表明，RA＞RD＞RC＞RB，即對(duì)蓮房黃酮得率影響的主次順序依次為：乙醇濃度＞微波功率＞提取時(shí)間＞料液比。表3方差分析結(jié)果，F(xiàn)B＜FC＜FD＜FA＜F0.05=4.460，表明各因素對(duì)蓮房黃酮得率的影響均不顯著。最佳提取工藝條件為A3B2C3D2，即乙醇濃度為70%，料液比為1∶15，提取時(shí)間為100s，微波功率為350W，在此條件下，經(jīng)平行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證（n=5），蓮房黃酮得率為11.42%。

表2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Design and results of orthogonal experiment

表3 正交實(shí)驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 3 Variance analysis results of orthogonal experiment

2.3 蓮房黃酮提取物抗氧化性能研究

2.3.1 蓮房黃酮提取物的還原力 反應(yīng)體系中，吸光度值的變化能反映出樣品還原力的高低，吸光度值越大表明樣品的還原力越強(qiáng)[13]。由圖5可知，隨著蓮房黃酮提取物質(zhì)量溶液的升高，它的還原力也在不斷增強(qiáng)，并且隨著濃度越來(lái)越高，還原力增加的趨勢(shì)也在加大。當(dāng)蓮房黃酮提取液質(zhì)量濃度為0.3mg/mL時(shí)，它的還原力與VC的還原力相當(dāng)。整體來(lái)說(shuō)，蓮房黃酮提取液的還原力不如VC的還原力。

圖5 蓮房黃酮提取液的還原力Fig.5 Total reduction of flavonoid

2.3.2 蓮房黃酮提取物對(duì)DPPH自由基的清除率 由圖6可知，蓮房黃酮提取液質(zhì)量濃度由0.05mg/mL增加至0.3mg/mL時(shí)，它對(duì)DPPH·的清除率增加也較快；隨著濃度的進(jìn)一步升高，對(duì)DPPH·的清除率也在增大，但此時(shí)增長(zhǎng)速率較慢。對(duì)照品VC和BHT對(duì)DPPH·的清除率也均隨著質(zhì)量濃度的增加而增大。黃酮提取液對(duì)DPPH·的清除率與VC相比，不如VC對(duì)DPPH·的清除效果明顯。與BHT相比，當(dāng)黃酮提取液質(zhì)量濃度比較小時(shí)，對(duì)DPPH·的清除率不如BHT；但當(dāng)黃酮提取液質(zhì)量濃度達(dá)到0.3mg/mL后，它對(duì)DPPH·的清除率與BHT對(duì)DPPH·的清除率相當(dāng)。

圖6 蓮房黃酮提取液對(duì)DPPH自由基的清除作用Fig.6 Scavenging activity of flavonoid on the DPPH free radical

圖7 蓮房黃酮提取液對(duì)羥基自由基的清除作用Fig.7 Scavenging activity of flavonoid on the hydroxyl free radical

2.3.3 蓮房黃酮提取物對(duì)羥基自由基清除率 由圖7可以看出，蓮房黃酮提取液具有一定的清除羥基自由基的作用，隨著黃酮提取液質(zhì)量濃度的增加，對(duì)羥基自由基的清除率也在增強(qiáng)。對(duì)照品VC對(duì)羥基自由基的清除率也隨著其質(zhì)量濃度的增加而升高，在質(zhì)量濃度較低時(shí)，蓮房黃酮提取液清除羥基自由基的效果不如VC，但當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到0.3mg/mL時(shí)，發(fā)現(xiàn)蓮房黃酮提取液對(duì)羥基自由基的清除能力大于VC的清除能力。

3 結(jié)論

研究了微波輔助提取蓮房黃酮的工藝，結(jié)果表明影響蓮房黃酮得率的主要因素是乙醇濃度，其次是微波功率和提取時(shí)間，料液比的影響最小。經(jīng)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化后的工藝參數(shù)為：乙醇濃度為70%，料液比為1∶15，提取時(shí)間為100s，微波功率為350W，在此條件下，蓮房黃酮得率為11.42%。微波輔助提取法可以通過(guò)高能作用促進(jìn)目的物從溶質(zhì)中的溶出，具有高效、操作簡(jiǎn)單、用時(shí)短、產(chǎn)率高、雜物少等特點(diǎn)，有利于蓮房黃酮的提取，可以成為提取蓮房黃酮的首選方法之一。

樣品抗氧化性能評(píng)價(jià)方法有很多種，還原力與抗氧化能力存在密切的關(guān)系，還原力越強(qiáng)，表現(xiàn)出的抗氧化能力也就越強(qiáng)[14-15]。DPPH自由基因?yàn)椴僮骱?jiǎn)便、快速，廣泛應(yīng)用于抗氧化活性評(píng)價(jià)。羥基自由基在生物體內(nèi)對(duì)機(jī)體的危害很大，是較強(qiáng)的氧化劑?？寡趸瘜?shí)驗(yàn)表明，蓮房黃酮提取物具有較強(qiáng)的還原力，還原力隨著黃酮提取物質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)。蓮房黃酮提取物對(duì)DPPH自由基和羥基自由基均有一定的清除率，但清除效果不一樣。蓮房黃酮提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力不如同質(zhì)量濃度的BHT和VC，但蓮房黃酮提取物對(duì)羥基自由基的清除能力與同質(zhì)量濃度的VC相當(dāng)，甚至在質(zhì)量濃度較高時(shí)，超過(guò)VC。這可能是因?yàn)樯彿奎S酮提取物對(duì)不同的自由基表現(xiàn)的敏感性不同?？偟膩?lái)說(shuō)，蓮房黃酮提取物具有較強(qiáng)的抗氧化活性，可以作為天然氧化劑的潛在來(lái)源。

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