馮 敏，劉延琳*

(西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

微衛(wèi)星DNA由短的核心序列(一般1～6bp)串聯(lián)重復(fù)構(gòu)成，故也被稱為簡單重復(fù)序列(simple sequence repeats, SSRs)，如(CA)n、(GTG)n等，其中雙核苷酸重復(fù)最為常見，其次為3個核苷酸或者4個核苷酸的重復(fù)。微衛(wèi)星在真核生物基因組中廣泛存在且均勻分布，在酵母中，每100kb就有1.8個微衛(wèi)星位點(diǎn)[1-2]。自釀酒酵母全基因組序列公布以后，科學(xué)家開始構(gòu)建搜索釀酒酵母微衛(wèi)星序列的方法，并取得顯著成果[2-5]。因微衛(wèi)星在真核生物基因組中種類多、分布廣，呈選擇中性和共顯性遺傳，多態(tài)性豐富且在種內(nèi)高度保守，一些學(xué)者已將微衛(wèi)星位點(diǎn)的組合分析用于釀酒酵母分型和遺傳多樣性研究，但尚未達(dá)到該技術(shù)的最大分辨率[6-9]。鑒于此，Legras等[10-11]對41個微衛(wèi)星位點(diǎn)的多態(tài)信息進(jìn)行評估和篩選，得到6個穩(wěn)定的高變異微衛(wèi)星位點(diǎn)，而這6個位點(diǎn)豐富的多態(tài)性也在隨后其他學(xué)者的研究中得到認(rèn)可。近年來，隨著微衛(wèi)星序列搜索技術(shù)、引物開發(fā)技術(shù)和檢測分析技術(shù)的不斷完善，其在釀酒酵母相關(guān)研究中得到了更為廣泛的應(yīng)用，并呈現(xiàn)出廣闊的發(fā)展前景。

1 微衛(wèi)星的應(yīng)用原理

1.1 微衛(wèi)星位點(diǎn)多態(tài)性形成機(jī)理

微衛(wèi)星DNA因其核心序列重復(fù)次數(shù)不同及重復(fù)程度不同形成了每個座位的多態(tài)性[12]，而重復(fù)次數(shù)的差異是DNA復(fù)制和修復(fù)過程中滑動錯配或減數(shù)分裂過程中非姐妹染色單體的不等交換所致[13-14]。而微衛(wèi)星的進(jìn)化則是通過鏈滑移而非重組[15]。此外，Messier等[16]認(rèn)為微衛(wèi)星序列越長，其多態(tài)性也越豐富，其原因是在DNA復(fù)制或者修復(fù)時，滑動鏈與互補(bǔ)鏈堿基錯配，如果錯配不能修復(fù)，將會導(dǎo)致一個或幾個重復(fù)單位的插入或缺失。而微衛(wèi)星越長，產(chǎn)生錯配的機(jī)會越大，微衛(wèi)星多態(tài)性也越豐富。

1.2 微衛(wèi)星位點(diǎn)分析方法

1.2.1 分析原理

微衛(wèi)星核心序列兩側(cè)的側(cè)翼序列在種內(nèi)高度保守，這是設(shè)計適當(dāng)引物擴(kuò)增微衛(wèi)星核心序列的基礎(chǔ)?；趥?cè)翼序列在種內(nèi)高度的特異性和核心序列因重復(fù)次數(shù)差異產(chǎn)生的多態(tài)性，可使用某微衛(wèi)星位點(diǎn)的特異引物，以不同個體的基因組DNA為模板，對該位點(diǎn)的核心序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。若同源染色體某個微衛(wèi)星位點(diǎn)的核心序列重復(fù)數(shù)目相同，則該個體在這個位點(diǎn)是純合的，否則便是雜合的。

1.2.2 分析方法

微衛(wèi)星PCR結(jié)果經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳，毛細(xì)管電泳檢測或者測序后，通過POPGENE1.32，Microsatellite_tool kit，GENEPOP1.2等軟件對微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因數(shù)、基因雜合度(heterozygosity，H)和多態(tài)信息含量(polymorphism information content，PIC)是衡量群體微衛(wèi)星變異程度的指標(biāo))進(jìn)行統(tǒng)計分析[17-19]。利用AMOVA、NTSYSpc 2.0、PHYLIP3.6等分析釀酒酵母菌株親緣關(guān)系、釀酒酵母群體的遺傳關(guān)系等[20-22]。

1.2.3 釀酒酵母研究中常用微衛(wèi)星位點(diǎn)信息

常用微衛(wèi)星位點(diǎn)信息見表1。

2 微衛(wèi)星在釀酒酵母分類鑒定中的應(yīng)用

2.1 微衛(wèi)星用于鑒定釀酒酵母

Schuller等[28]分別用6個微衛(wèi)星位點(diǎn)PCR、interdelta序列分析和線粒體DNA HinfⅠ酶切3種方法考察23株商業(yè)酵母，每種方法均得到21種基因型，Schuller指出這3種方法均可作為鑒定釀酒酵母的常規(guī)方法在釀酒工業(yè)中廣泛應(yīng)用。Vaudano等[29]利用3個微衛(wèi)星位點(diǎn)多重PCR和聚丙烯酰胺凝膠電泳，對30株釀酒酵母商業(yè)菌株進(jìn)行區(qū)分，其中除DSM Fermivin和Laffort Zymaflore ST兩株菌之外，其余28株菌表現(xiàn)出明顯的帶型差異。此外，他還對所選微衛(wèi)星標(biāo)記的穩(wěn)定性及實(shí)驗方法的可重復(fù)性進(jìn)行驗證，指出微衛(wèi)星標(biāo)記穩(wěn)定性好，靈敏度高，可用于檢測工業(yè)發(fā)酵中野生酵母的污染。Howell等[26]通過微衛(wèi)星位點(diǎn)SC8132X對6個釀酒酵母群體進(jìn)行分型，得到4個多態(tài)類群，從中選擇3種不同分型的菌株混合發(fā)酵，利用微衛(wèi)星PCR對發(fā)酵過程中釀酒酵母種群進(jìn)行監(jiān)控，指出發(fā)酵是一個動態(tài)變化過程，發(fā)酵始末釀酒酵母群體結(jié)構(gòu)存在差異。Pérez等[9]從10個微衛(wèi)星位點(diǎn)中選出6個高多態(tài)性位點(diǎn)，對來自不同酒廠的51株釀酒酵母進(jìn)行區(qū)分，得到57個等位基因和44個基因型。Pérez指出多個微衛(wèi)星位點(diǎn)組合分析具有很高的分辨率。González Techera等[23]曾對烏拉圭的6株本土釀酒酵母和3株商業(yè)釀酒酵母進(jìn)行區(qū)分，通過3個微衛(wèi)星位點(diǎn)PCR擴(kuò)增和多態(tài)性分析，成功區(qū)分上述9個菌株。他認(rèn)為由于微衛(wèi)星分型結(jié)果可轉(zhuǎn)換為數(shù)量數(shù)據(jù)，故比其他分型技術(shù)具有更大的優(yōu)越性，并提議可將該方法作為鑒定釀酒酵母的常規(guī)方法。

2.2 微衛(wèi)星用于構(gòu)建釀酒酵母菌株分型數(shù)據(jù)庫

Jubany等[24]曾提出基于微衛(wèi)星位點(diǎn)和SNPs對釀酒酵母菌株進(jìn)行分型的標(biāo)準(zhǔn)方法，他們利用從33個微衛(wèi)星位點(diǎn)中篩選出的9個高多態(tài)性位點(diǎn)對120個菌株進(jìn)行分析，并結(jié)合FLO8的SNPs分析，初步構(gòu)建釀酒酵母菌株微衛(wèi)星和SNPs分型數(shù)據(jù)庫(www.pasteur.edu.uy/yeast)，旨在收集和規(guī)范來自不同實(shí)驗室的數(shù)據(jù)。Jubany選擇S288C和AB972作為參考菌株，供試菌株某位點(diǎn)的分析結(jié)果以其與參考菌株該位點(diǎn)的重復(fù)數(shù)差異來表示，比如，+4表示供試菌株比參考菌株在該位點(diǎn)多4個重復(fù)，而－7則表示比參考菌株少7個重復(fù)。這種用重復(fù)數(shù)差異來表示等位基因的方法，第一次使得不同實(shí)驗室之間實(shí)驗結(jié)果的交換和共享成為可能。隨后Richards等[25]基于10個微衛(wèi)星位點(diǎn)和MAT位點(diǎn)構(gòu)建了另一個釀酒酵母分型數(shù)據(jù)庫，該數(shù)據(jù)庫包含246個菌株：78株葡萄酒商業(yè)酵母、103株世界各地的野生酵母、34株由 Saccharomyces genome resequencing project(SGRP)測序的野生酵母、31株新西蘭酒廠分離的酵母。故可直接比較這34個菌株DNA序列數(shù)據(jù)與微衛(wèi)星基因型之間的關(guān)系。該研究首次提出建立菌株DNA序列與微衛(wèi)星基因型之間的對應(yīng)關(guān)系。

表 1 常用微衛(wèi)星位點(diǎn)信息Table 1 Characteristics and primers of hypervariable SSR loci in Saccharomyces cerevisiae

3 微衛(wèi)星在釀酒酵母菌株倍性確定中的應(yīng)用

Ezov等[30]從以色列和美國卡梅爾的“進(jìn)化峽谷”分離得到68個野生釀酒酵母單菌落，利用19對微衛(wèi)星引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對每個位點(diǎn)等位基因數(shù)目和雜合度進(jìn)行計算，發(fā)現(xiàn)所選19個位點(diǎn)都具有較高的等位基因多態(tài)性，平均每株菌每個位點(diǎn)有5.1個等位基因。Ezov認(rèn)為如果一個菌株每個位點(diǎn)有1～4個等位基因，這便預(yù)示著該菌株可能為多倍體，他預(yù)測68株釀酒酵母中包含有二倍體、三倍體，甚至還有四倍體。之后通過流式細(xì)胞術(shù)分析(flow cytometry analysis，F(xiàn)ACS)，Ezov的預(yù)測得到確認(rèn)，分別有21個二倍體菌株，7個三倍體和40個四倍體。Muller等[31]選擇12個微衛(wèi)星位點(diǎn)對170株臨床和非臨床釀酒酵母菌株進(jìn)行分析，得到161種基因型，每個位點(diǎn)有16～42個等位基因，平均每個位點(diǎn)有27個等位基因。而每株菌每個位點(diǎn)都有1～4個等位基因，暗示這些菌株存在倍性差異。Muller預(yù)測55%的菌株是二倍體，14%為三倍體，11%為四倍體。最后，臨床菌株雜合子的比例高于非臨床菌株，暗示在臨床環(huán)境中雜合子菌株的選擇性優(yōu)勢。

4 微衛(wèi)星在釀酒酵母親緣關(guān)系確定方面的應(yīng)用

Mercado等[32]連續(xù)兩年從ZARM產(chǎn)區(qū)的酒廠設(shè)備和馬爾貝克葡萄汁的自然發(fā)酵過程中采樣，從所分離釀酒酵母中選擇出28個代表菌株，連同來自法國的7株商業(yè)酵母，通過interdelta分型、mtDNA限制分析和微衛(wèi)星PCR 3種方法考察它們之間的親緣關(guān)系。3種方法結(jié)合分析，可準(zhǔn)確區(qū)分34株釀酒酵母。研究結(jié)果顯示，一些菌株其來源雖相同，但分子關(guān)系復(fù)雜，系統(tǒng)發(fā)生樹也會隨分析方法的不同存在差異；同時，根據(jù)不同的研究目的選擇不同分析方法的重要性和必要性。Malgoire等[33]對來自法國醫(yī)學(xué)中心的69株釀酒酵母和8個參考菌株(5株釀酒酵母，3株布拉酵母)進(jìn)行親緣關(guān)系分析，共選擇5個微衛(wèi)星位點(diǎn)，得到34個等位基因，64種電泳類型，并對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行因子對應(yīng)分析，結(jié)果聚為3類，類群Ⅰ只包含臨床菌株，類群Ⅱ包含釀酒酵母參考菌株，類群Ⅲ則由布拉酵母參考菌株構(gòu)成。他評價微衛(wèi)星可揭示臨床釀酒酵母菌株高度多樣性，是研究酵母親菌株緣關(guān)系的有力工具。

5 微衛(wèi)星在釀酒酵母群體研究中的應(yīng)用

Schuller等[27]在2001—2003年間從葡萄牙3個葡萄園分離得到1260個釀酒酵母單菌落，經(jīng)過mtDNA-RFLP初步分型，得到361個不同類群，隨后對其6個高多態(tài)微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行分析，共得到93個等位基因，其中52個首次被報道。假設(shè)所選位點(diǎn)均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)，經(jīng)計算，6個位點(diǎn)雜合度觀測值(observed heterozygosity，Ho)均低于期望值(expected heterozygosity，He)3～4倍，暗示供試群體的無性繁殖及子結(jié)構(gòu)化。此外，3個葡萄園釀酒酵母群體間的遺傳差異表現(xiàn)為等位基因頻率的不同。該研究第一次使用微衛(wèi)星分型技術(shù)對大量本土釀酒酵母菌株進(jìn)行生態(tài)研究，為釀酒酵母菌株生態(tài)學(xué)和生物地理學(xué)研究奠定基礎(chǔ)，也為生物多樣性和遺傳資源的保護(hù)提供依據(jù)。Pereira等[34]曾累計4a(2001—2003年， 2006年)從5個產(chǎn)區(qū)(Estremadura、Palmela、 Alentejo、Vinho Verde、Bairrada)20個葡萄園和9個葡萄品種分離得到4470個釀酒酵母菌株單菌落。通過mtDNA-RFLP和interdelta-PCR結(jié)合分析后得到502個類群，從每個類群各選擇一株釀酒酵母作為代表菌株，進(jìn)行10個位點(diǎn)的微衛(wèi)星PCR，得到192個等位基因，計算亞群間(這里指來自不同產(chǎn)區(qū)的類群)的遺傳分化程度指標(biāo)(Fst)和等位基因頻率相似矩陣，并基于此構(gòu)建不同亞群的系統(tǒng)樹。結(jié)果顯示，釀酒酵母群體的遺傳差異主要來自特定葡萄園特異等位基因的差異及10個位點(diǎn)等位基因頻率微小差異的積累，這些差異可用于鑒定群體結(jié)構(gòu)；4個年份中，同一個葡萄園均分離出相同或類似的釀酒酵母菌株，暗示每個葡萄園都有其不同于其他葡萄園的酵母群體，且特異性本土酵母的出現(xiàn)可能與風(fēng)土有關(guān)。

工業(yè)生產(chǎn)中形形色色的發(fā)酵產(chǎn)品背后隱藏著釀酒酵母菌株迷人的遺傳多樣性，保護(hù)酵母多樣性的核心內(nèi)容就是保護(hù)酵母的遺傳多樣性。微衛(wèi)星技術(shù)可揭示菌株地理起源和遺傳特征之間的關(guān)系、兩兩菌株之間的關(guān)系及釀酒酵母群體之間的關(guān)系，是分析釀酒酵母多樣性的有力工具。隨著微衛(wèi)星序列搜索技術(shù)、引物開發(fā)技術(shù)和檢測分析技術(shù)的不斷完善，微衛(wèi)星標(biāo)記將會在釀酒酵母研究中表現(xiàn)出更強(qiáng)的生命力，為本土釀酒酵母菌株遺傳多樣性的保護(hù)和開發(fā)提供更大便利，為釀酒酵母群體生態(tài)學(xué)研究開拓更多視角。

[1] TAUTZ D, RENZ M. Simple sequences are ubiquitious repetitive components of eukaryote genomes[J]. Nucl Acids Res, 1984, 12： 4127-4138.

[2] FIELD D, WILLS C. Abundant microsatellite polymorphism in Saccharomyces cerevisiae, and the different distribution in eight prokaryotes and S. cerevisiae, result from strong mutation pressures and a variety of selective forces[C]// Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, America： 1998.

[3] GOFFEAU A, BARRELL B G, BUSSEY H, et al. Life with 6000 genes[J]. Science, 1996, 274： 563-567.

[4] KATTI M V, RANJEKAR P K, GUPTA V S. Differential distribution of simple sequence repeats in eukaryotic genome sequences[J]. Mol Biol Evol, 2001, 18： 1161-1167.

[5] AISHWARYA V, GROVER A, SHARMA P C. EuMicroSatdb： a database for microsatellites in the sequenced genomes of eukaryotes[J]. BMC Genomics, 2007, 8： 225-234.

[6] GALLEGO F J, PEREZ G, MARTINEZ I, et al. Microsatellites obtained from database sequences are useful to characterize Saccharomyces cerevisiae[J]. American Journal of Enology and Viticulture, 1998, 49： 350-351.

[7] HENNEQUIN C, THIERRY A, RICHARD G F, et al. Microsatellite typing as a new tool for identification of Saccharomyces cerevisiae strains[J]. Journal of Clinical Microbiology, 2001, 39： 551-559.

[8] TECHERA A G, JUBANY S, CARRAU F M, et al. Differentiation of industrial wine yeast strains using microsatellite markers[J]. Letters in Applied Microbiology, 2001, 33： 71-75.

[9] PéREZ M A, GALLEGO F J, MARTINEZ I, et al. Detection, distribution and selection of microsatellites (SSRs) in the genome of the yeast Saccharomyces cerevisiae as molecular markers[J]. Letters in Applied Microbiology, 2001, 33： 461-466.

[10] LEGRAS J L, RUH O, MERDINOGLU D, et al. Selection of hypervariable microsatellite loci for the characterization of Saccharomyces cerevisiae strains[J]. International Journal of Food Microbiology, 2005, 102： 73-83.

[11] LEGRAS J L, MERDINOGLU D, CORNUET J M, et al. Bread, beer and wine： Saccharomyces cerevisiae diversity reflects human history[J]. Mol Ecol, 2007, 16： 2091-2102.

[12] WEBER J L. Informativeness of human (dC-dA)n.(dG-dT)npolymorphisms[J]. Genomics, 1990, 7(4)： 524-530.

[13] SCHLOTTERER C, TAUTZ D. Slippage synthesis of simple sequence DNA[J]. Nucleic Acids Res, 1992, 20(2)： 211-215.

[14] ELLEGREN H. Microsatellite mutations in the germline： implications for evolutionary inference[J]. Trends Genet, 2000, 16： 551-558.

[15] PUPKO T, GRAUR D. Evolution of microsatellites in the yeast saccharomyces cerevisiae： role of length and number of repeated units[J]. Molecular Evolution, 1999, 48(3)： 313-316.

[16] MESSIER W, LI S, STEWART C. The birth of microsatellites[J]. Nature, 1996, 381： 483.

[17] BARTON N H, SLATKIN M. A quasi-equilibrium theory of the distribution of rare alleles in a subdivided population[J]. Heredity, 1986, 56： 409-415.

[18] DEMPSTER A P, LAIRD N M, RUBIN D B J. Maximum likelihood from incomplete data via the Emalgorithm[J]. Royal Statistics Society B, 1977, 39： 1-38.

[19] RAYMOND M, ROUSSET F. Genepop(version 1.2)： population genetics software for exact tests and ecumenicism[J]. Heredity, 1995, 86： 248-249.

[20] ROUSSET F. Equilibrium values of measure of population subdivision for stepwise mutation process[J]. Genetics, 1996, 142： 1357-1362.

[21] WEIR B S, COCKERHAM C C. Estimating F-statistics for the analysis of population structure[J]. Evolution, 1984, 38： 1358-1370.

[22] PATHANIA N, KANWAR S S, JHANG T, et al. Application of different molecular techniques for deciphering genetic diversity among yeast isolates of traditional fermented food products of Western Himalayas[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2012, 26(9)： 1539-1547.

[23] GONZáLEZ TECHERA A, JUBANY S, CARRAUAND F M, et al. Differentiation of industrial wine yeast strains using microsatellite markers[J]. Letters in Applied Microbiology, 2001, 33： 71-75.

[24] JUBANY S, TOMASCO I, de LEO’N I P, et al. Toward a global database for themolecular typing of Saccharomyces cerevisiae strains[J]. FEMS Yeast Res, 2008, 8： 472-484.

[25] RICHARDS K D, GODDARD M R, GARDNER R C. A database of microsatellite genotypes for Saccharomyces cerevisiae[J]. Antonie van Leeuwenhoek, 2009, 96： 355-359.

[26] HOWELL K S, BARTOWSKY E J, FLEET G H, et al. Microsatellite PCR profiling of Saccharomyces cerevisiae strains during wine fermentation[J]. Letters in Applied Microbiology, 2004, 38： 315-320.

[27] SCHULLER D, CASAL M. The genetic structure of fermentative vineyard-associated Saccharomyces cerevisiae populations revealed by microsatellite analysis[J]. Antonie van Leeuwenhoek, 2007, 91： 137-150.

[28] SCHULLER D, VALERO E, DEQUIN S, et al. Survey of molecular methods for the typing of wine yeast strains[J]. FEMS Microbiology Letters, 2004, 231： 9-26.

[29] VAUDANO E, GARCIA-MORUNO E. Discrimination of Saccharomyces cerevisiae wine strains using microsatellite multiplex PCR and band pattern analysis[J]. Food Microbiology, 2008, 25： 56-64.

[30] EZOV T K, BOGER-NADJAR E, FRENKEL Z, et al. Moleculargenetic biodiversity in a natural population of the yeast Saccharomyces cerevisiae from‘EvolutionCanyon’： microsatellite polymorphism, ploidy andcontroversial sexual status[J]. Genetics, 2006, 174： 1455-1468.

[31] MULLER L A H, MCCUSKER J H. Microsatellite analysis of genetic diversity among clinical and nonclinical Saccharomyces cerevisiae isolates suggests heterozygote advantage in clinical environments[J]. Molecular Ecology, 2009, 18： 2779-2786.

[32] MERCADO L, JUBANY S, GAGGERO C, et al. Molecular relationships between Saccharomyces cerevisiae strains involved in winemaking from mendoza, argentina[J]. Curr Microbiol, 2010, 61： 506-514.

[33] MALGOIRE J Y, BERTOUT S, RENAUD F, et al. Typing of Saccharomyces cerevisiae clinical strains by using microsatellite sequence polymorphism[J]. Journal of Clinical Microbiology, 2005, 3(43)： 1133-1137.

[34] PEREIRA L, FRANCO-DUARTE R, RAMOS P, et al. Populational analysis of Saccharomyces cerevisiae strains from different appellations of origin and grape varieties by microsatellite analysis[J]. Nature Precedings, doi：10.1038/npre.2008.2290.1, Posted 11 Sep 2008.