馬曉晴，董建軍，林 艷

(1.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，山東青島266061;2.青島啤酒股份有限公司，山東青島266061;3.啤酒生物發(fā)酵工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(籌)，山東青島266061)

啤酒麥芽是啤酒發(fā)酵的關(guān)鍵原料，有原料選擇不好會(huì)導(dǎo)致酵母超前絮凝(Premature Yeast Flocculation，簡稱PYF)現(xiàn)象產(chǎn)生。酵母超前絮凝現(xiàn)象是指當(dāng)營養(yǎng)物質(zhì)尚且充足時(shí)酵母就發(fā)生凝集沉降的現(xiàn)象。這種絮凝現(xiàn)象不僅對(duì)啤酒的發(fā)酵有一定影響，還可造成發(fā)酵中糖降解緩慢，利用率低，發(fā)酵不徹底，甚至導(dǎo)致啤酒不夠澄清，酒精含量低，口感差等問題［1］。Nierop［2］的研究也發(fā)現(xiàn)PYF 能夠引起發(fā)酵原料的使用不充分，導(dǎo)致浪費(fèi)現(xiàn)象，增大工廠費(fèi)用。引起酵母超前絮凝現(xiàn)象的原因有很多，多項(xiàng)研究表明引發(fā)這一現(xiàn)象的原因主要是微生物侵染大麥時(shí)，使大麥皮殼發(fā)生降解，產(chǎn)生一些高分子量的多糖，隨之進(jìn)入到發(fā)酵液中引發(fā)酵母絮凝［2-7］。楊春霞［8］等發(fā)現(xiàn)在制麥過程中麥芽受到一定量的霉菌污染時(shí)會(huì)引發(fā)PYF 現(xiàn)象。Nierop［2］也發(fā)現(xiàn)制麥過程中真菌的侵染可以使酵母過早絮凝。Axcell 等人［8］也提出了真菌分泌的酶可以作用大麥皮殼產(chǎn)生一些多糖，這些多糖組成了一部分PYF 因子，誘發(fā)酵母的超前絮凝。雖然不少學(xué)者都提出了真菌能夠影響酵母絮凝，但尚不明哪些真菌能夠明顯引起酵母超前絮凝。因此，本課題采用篩選自PYF 陽性麥芽中的霉菌，并反侵染大麥，觀察酵母提前絮凝，這是研究霉菌與酵母提前絮凝現(xiàn)象關(guān)系的最直接的方式，對(duì)相關(guān)方向的研究具有實(shí)際意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

啤酒麥芽 青島啤酒股份有限公司，為PYF 陰性麥芽和陽性麥芽，陰性麥芽即PYF 標(biāo)準(zhǔn)麥芽(PYF值為100%)，不發(fā)生酵母提前絮凝現(xiàn)象，陽性麥芽為有PYF 現(xiàn)象的麥芽;啤酒酵母 青島啤酒股份有限公司第五公司;馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)按照表1 配置1000mL 培養(yǎng)基，然后在121℃條件下滅菌20min;孟加拉紅培養(yǎng)基按照表2 配制1000mL 培養(yǎng)基，115℃滅菌30min。

EBCF 粉碎儀 Buhler;LB-8 糖化儀 Lochner;Z1 Particle Counter Beckman Coulter。

表1 PDA 培養(yǎng)基成分表Table 1 The component of PDA medium

表2 孟加拉紅培養(yǎng)基成分表Table 2 The component of Rose Bengal medium

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 啤酒麥芽真菌的分離鑒定

1.2.1.1 啤酒麥芽上微生物的分離純化 采用涂布法，接種于孟加拉紅平板培養(yǎng)基上，并設(shè)置3 個(gè)平行組。倒置于32℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)48～72h。然后挑取帶有個(gè)體特征差異的單菌落并分別接種于PDA 平板培養(yǎng)基上，在32℃恒溫倒置培養(yǎng)，待菌落長出后，檢查其個(gè)體形態(tài)特點(diǎn)是否一致，重復(fù)此步驟至純化后轉(zhuǎn)移至PDA 培養(yǎng)基斜面上，32℃恒溫培養(yǎng)長出，4℃條件下保存。

1.2.1.2 生理生化特征和顯微形態(tài)觀察 用顯微鏡對(duì)染色后的菌體進(jìn)行形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察，甲基藍(lán)［9-10］作染色液，記錄形態(tài)特點(diǎn)。

1.2.1.3 啤酒麥芽中微生物的分子生物學(xué)鑒定 由中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室完成鑒定。

1.2.2 酵母絮凝實(shí)驗(yàn) 該實(shí)驗(yàn)是采用PYF 值測(cè)定的方法來判斷酵母的絮凝性，通過對(duì)PYF 陰性麥芽皮殼進(jìn)行微生物處理，與無處理的麥芽對(duì)比分析，測(cè)定發(fā)酵液中懸浮的酵母數(shù)以及殘?zhí)菨舛取?/p>

1.2.2.1 麥皮預(yù)處理 稱取一定量的標(biāo)準(zhǔn)麥芽用EBCF 粉粹機(jī)完全粉碎，然后用孔徑0.9mm 的20 目篩子將皮殼與麥粉分離。取2.5g 皮殼加入到250mL錐形瓶中，并倒入200mL 蒸餾水，分別接種一定量的真菌，100r/min 搖床培養(yǎng)20h。

1.2.2.2 麥汁制備 采用協(xié)定麥汁的方法，用LB-8糖化設(shè)備制備協(xié)定麥汁，雙層濾紙過濾。

1.2.2.3 麥汁前酵分析 實(shí)驗(yàn)中麥汁是由PYF 陰性麥芽和實(shí)驗(yàn)麥芽制得的，為了確保絮凝現(xiàn)象發(fā)生的差異不是由麥汁本身營養(yǎng)物質(zhì)差異引起的，協(xié)定麥汁后用糖度計(jì)測(cè)定糖度，補(bǔ)加葡萄糖，確保麥汁糖濃度是在同一水平。

1.2.2.4 酵母準(zhǔn)備 無菌操作取生產(chǎn)使用的酵母泥(2～4 代，由青島啤酒第五有限公司提供)，取回后放置冰箱內(nèi)，在8h 內(nèi)使用。取一支用酒精棉擦拭的40mL 離心管，移入酵母泥，于4000r/min 離心10min，傾去上清液;另取一支用酒精棉擦拭的40mL離心管，稱取離心后的酵母泥1.95g，再加入22.5mL無菌蒸餾水，加蓋置于渦旋振蕩器上震蕩至充分混勻。

1.2.2.5 接種發(fā)酵 接種前，在裝有滅菌麥汁的SCOTT 瓶中加入一滴消泡劑，然后吸取充分混勻的酵母懸液2.5mL，加入麥汁中，充氧，靜置2～3min，輕輕搖動(dòng)后將麥汁倒入干燥、潔凈的50mL 比色管中，使用錫箔紙將口封住;立即置于20℃恒溫水浴中發(fā)酵40h。

2 結(jié)果與討論

2.1 啤酒麥芽皮殼上真菌種類結(jié)果分析

經(jīng)涂板分離純化和篩分后得到8 種菌，如圖1 所示，根據(jù)各菌種的形態(tài)可以看出2 號(hào)為黑曲霉，5 號(hào)為青霉，其余菌種不確定，對(duì)其做顯微鏡觀察和分子生物學(xué)鑒定。由各菌種形態(tài)學(xué)特征和ITS 區(qū)序列分析可知，8 種菌均為霉菌，結(jié)果見表3。

圖1 8 種霉菌在PDA 斜面培養(yǎng)基上形態(tài)Fig.1 The morphological characteristics of 8 kinds of fungi on PDA

2.2 PYF 值測(cè)定結(jié)果分析

從PYF 陽性麥芽上的菌種中分離篩選得到八種霉菌，分別為鐮刀菌、黑曲霉、白地霉、黃曲霉、青霉、芽枝孢菌、米根霉和極細(xì)鏈格孢菌。為了確定致PYF 現(xiàn)象的關(guān)鍵菌種，進(jìn)行酵母絮凝性實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)中分別用這八種菌處理麥芽皮殼，然后再制取麥汁，進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，測(cè)定PYF 值，重復(fù)多次，結(jié)果如圖2所示。

表3 啤酒麥芽上真菌鑒定結(jié)果Table 3 Result of fungi isolated from beer malt

當(dāng)PYF 值為0～85 時(shí)，酵母提前絮凝現(xiàn)象明顯，85～115 時(shí)酵母提前絮凝程度輕微，PYF 值在115 以上時(shí)酵母延遲絮凝。在多次實(shí)驗(yàn)中，米根霉及黃曲霉實(shí)驗(yàn)組PYF 值在0 ～85 范圍內(nèi)的比例均大于60%，有明顯致PYF 現(xiàn)象，且米根霉實(shí)驗(yàn)組最為突出，PYF 值在0～85 范圍內(nèi)的比例高達(dá)90%，兩種菌都是明顯致PYF 現(xiàn)象菌種;鐮刀菌實(shí)驗(yàn)組PYF 值在0～85 區(qū)間內(nèi)所占比例接近50%，屬于次明顯致PYF現(xiàn)象的菌種;白地霉和極細(xì)鏈格孢實(shí)驗(yàn)組PYF 值在85～115 范圍內(nèi)的比例大于60%，屬于致PYF 現(xiàn)象弱勢(shì)菌種;黑曲霉和芽枝孢菌實(shí)驗(yàn)組PYF 值在85～115范圍內(nèi)的比例接近50%，但也有致PYF 現(xiàn)象的可能;而青霉實(shí)驗(yàn)組PYF 值在三個(gè)范圍內(nèi)的比例分布較均勻，無明顯傾向，說明這種菌致PYF 現(xiàn)象不穩(wěn)定，這可能與菌種的量和酶活性有關(guān)，需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，確定量效關(guān)系。

圖2 PYF 測(cè)定結(jié)果餅圖Fig.2 The result of Premature Yeast Flocculation by pie chart

3 結(jié)論

啤酒麥芽受到污染后易引起PYF 現(xiàn)象，這與麥芽上的微生物相關(guān)，尤其是霉菌。從有PYF 現(xiàn)象的麥芽上分離出八種霉菌，分別為鐮刀菌、黑曲霉、白地霉、黃曲霉、青霉、芽枝孢菌、米根霉和極細(xì)鏈格孢菌。其中米根霉和黃曲霉為明顯致PYF 現(xiàn)象的菌種，鐮刀菌為致PYF 次級(jí)明顯菌種，極細(xì)鏈格孢菌和白地霉為致PYF 現(xiàn)象弱勢(shì)菌種，芽枝孢菌和黑曲霉為輕微致PYF 現(xiàn)象菌株，而青霉致PYF 現(xiàn)象不穩(wěn)定，這可能與菌種的量和酶活性有關(guān)，需要做進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

［1］欒靜，趙長新.酵母提前絮凝的研究進(jìn)展［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2008，34(12):139-142.

［2］Van Nierop S，Cameron- Clark A，Axcell B C.Enzymatic generation of factors from malt responsible for Premature Yeast Flocculation［J］.J Am Soc Brew Chem，2004，62(3):108-116.

［3］單連菊，郝俊光，趙玉祥，等.快速發(fā)酵法測(cè)定麥芽引起酵母提前絮凝(PFY)的方法的建立與應(yīng)用［J］.啤酒科技，2008(4):16-19.

［4］單連菊.麥芽對(duì)酵母絮凝的影響機(jī)理分析及評(píng)估方法比較［J］.啤酒科技，2008(1):18-22.

［5］錢盛烽，胡維勝，林英輝，等.不同復(fù)合酶制劑對(duì)麥芽中PYF 因子酵母超前絮凝活力的影響［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36(7):2610-2611.

［6］Herrera V E，Axcell B C. Induction of premature yeast flocculation by on polysaccharide fraction isolated from malt husk［J］.J Inst Brew，1991，97:359-366.

［7］Morimoto K，Shimazut，F(xiàn)ujii T，et al.Some substances in malt inducing early flocculation of yeast［R］.Rep Res Lab Kirin Brew Co，1975，18:63-74.

［8］Axcell B，van Nierop S，Vundla W.Malt induced Premature Yeast Flocculation［J］.Master Brewer Association of American，2000，37:501-504.

［9］陳倪勇，肖永波.介紹一種真菌的染色方法［J］.中華病理學(xué)雜志，2001，30(5):383-384.

［10］黃霞云，劉晶杰.真菌染色新方法的探索［J］.實(shí)用醫(yī)技雜志，2006，13(11):1862-1863.