徐愛才，馬成杰，華寶珍，杜昭平，徐志平，劉 軍

(1.光明乳業(yè)股份有限公司技術(shù)研究中心華中研究所，湖北武漢430040;2.武漢工業(yè)學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院，湖北武漢430023)

乳與乳制品是營養(yǎng)成分十分豐富的天然食品，是人類不可或缺的一類營養(yǎng)品。人剛出生時，腸道內(nèi)乳糖酶活性最高，可以有效的降解乳及乳制品中的乳糖，但隨著人的生長發(fā)育，體內(nèi)乳糖酶活性呈規(guī)律性衰減，導(dǎo)致許多青少年、成年人和老年人存在著不同程度的乳糖不耐癥，從而影響了人們對乳制品的正常攝入［1-4］。酸奶是牛乳經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后的一種乳制品，其牛乳中所含的乳糖在乳酸菌發(fā)酵后能降解約30%～40%［5］，雖能一定程度上緩解乳糖不耐癥，但對那些乳糖不耐癥狀嚴(yán)重的患者，尤其是老年人來說普通酸奶仍無法滿足他們的需求，因此必須開發(fā)出低乳糖甚者無乳糖乳制品來滿足市場的需求［6］。乳糖經(jīng)乳糖酶分解后生成葡萄糖和半乳糖，不僅能有效解決乳糖不耐受的問題，同時賦予了牛乳更高的甜味，因此利用乳糖酶水解乳糖為低乳糖乳制品的開發(fā)提供了一種途徑。鑒于此，本研究利用乳糖酶對牛乳中的乳糖進(jìn)行酶解，并比較酶解前后乳酸菌的發(fā)酵曲線，發(fā)酵乳在貯藏過程中后酸化速度、黏度、活菌數(shù)量及主要風(fēng)味物質(zhì)含量的變化，以期為低乳糖酸奶的開發(fā)提供一定的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮牛乳 武漢光明乳品有限公司;發(fā)酵劑 丹麥DANISCO 公司;中性乳糖酶 哈爾濱華美生物技術(shù)股份有限公司;乳糖/半乳糖試劑盒 Boehringer Mannheim 公司;MRS Merck 公司 其它均為國產(chǎn)分析純。

Brookfield Dv-1 VISCOM ETER 黏度儀 德國Marimex 公司;紫外可見分光光度計 日本島津UV-1800;臺式冷凍大容量高速離心機(jī) 德國eppendorf 公司;Cinac 發(fā)酵素酸化監(jiān)控系統(tǒng) 法國ALLIANCE 公司;數(shù)顯pH 計 瑞士梅特勒托利多公司;超凈工作臺 上?？茖W(xué)儀器廠;MIR-253 生化培養(yǎng)箱 日本SANYO 公司;SA-300VF 滅菌鍋 德國Sturdy Industrial 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 酸奶工藝流程 低乳糖酸奶工藝流程:鮮牛乳→預(yù)熱(65～70℃) →加8%蔗糖→均質(zhì)(140～160MPa) →殺菌(95℃，5min) →冷卻(37～39℃) →酶解( 水解率70%) →滅酶(65℃，15min) →冷卻至(42℃) 接入發(fā)酵劑發(fā)酵10h 后結(jié)束發(fā)酵。

普通酸奶工藝流程:鮮牛乳→預(yù)熱(65～70℃) →加8%蔗糖→均質(zhì)( 140～160MPa) →殺菌( 95℃，5min) →冷卻(42℃) 接入發(fā)酵劑發(fā)酵10h 后結(jié)束發(fā)酵。

1.2.2乳糖水解率的測定 采用 Boehringer Mannheim 乳糖/半乳糖試劑盒測定乳糖的水解率，其中:水解率(%)=(1-水解后酸奶中的乳糖含量/水解前牛乳中的乳糖含量)×100%。

1.2.3 牛乳發(fā)酵過程中pH 的測定 采用Cinac 發(fā)酵素酸化監(jiān)控系統(tǒng)對牛乳發(fā)酵過程中pH 的變化進(jìn)行監(jiān)測。

1.2.4 發(fā)酵乳酸度的測定 發(fā)酵乳的酸度以酚酞為指示劑，用0.1000mol/L 的NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定。滴定酸度以吉爾涅爾度(°T)表示，即每100mL 樣品消耗NaOH 溶液的體積，每個實驗重復(fù)3 次，取平均值［7］。

1.2.5 發(fā)酵乳黏度的測定 將發(fā)酵乳樣品調(diào)溫至20～22℃，采用Brookfield Dv-1 VISCOM ETER 黏度儀(MA)4#轉(zhuǎn)子進(jìn)行測定，其中轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速為30r/min，測定時間為30s，重復(fù)測定3 次，取其平均值。

1.2.6 發(fā)酵乳中活菌數(shù)含量的測定 牛乳經(jīng)發(fā)酵10h 后利用IKA RW20 digital 攪拌器600r/min 攪拌3min，分別在第0、5、10、15、20、25d 取樣利用培養(yǎng)基MRS 采用稀釋傾注平皿法檢測發(fā)酵乳中乳桿菌的活菌數(shù)［8］。

1.2.7 發(fā)酵乳中雙乙酰含量的測定 鄰苯二胺可以與聯(lián)二酮類反應(yīng)生成2，3-二甲基并吡嗪，生成物的鹽酸鹽在335nm 波長下有最大吸收，可測出丁二酮的含量［9］。每個實驗重復(fù)3 次，取平均值。

1.2.8 發(fā)酵乳中乙醛含量的測定 乙醛在酸性條件下與亞硫酸氫鈉發(fā)生加成反應(yīng)，其剩余的亞硫酸氫鈉被碘氧化，在堿性條件下乙醛亞硫酸氫鈉與碘定量反應(yīng)，根據(jù)反應(yīng)當(dāng)量關(guān)系計算乙醛含量［10］。每個實驗重復(fù)3 次，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛乳經(jīng)乳糖酶水解前后發(fā)酵曲線的比較

牛乳經(jīng)乳糖酶水解后巴氏殺菌，冷卻至42℃按質(zhì)量比0.02%添加發(fā)酵劑，同時以未經(jīng)乳糖酶水解巴氏殺菌的牛乳做對照，利用Cinac 發(fā)酵素酸化監(jiān)控系統(tǒng)對發(fā)酵過程中酸乳pH 變化進(jìn)行監(jiān)測，pH 變化如圖1 所示。

圖1 樣品pH-發(fā)酵時間的變化Fig.1 Changes of samples in pH during fermentation

由圖1 可知，牛乳經(jīng)乳糖酶水解后的發(fā)酵曲線與未經(jīng)乳糖酶處理的發(fā)酵曲線有一定的差異。發(fā)酵10h 后，經(jīng)乳糖酶處理的樣品pH 由6.45 下降至4.38，而未經(jīng)乳糖酶處理的樣品的pH 由6.45 下降至4.56，發(fā)酵結(jié)束時前者的pH 比后者低0.18。接入發(fā)酵劑前1h，兩種處理pH 下降均比較緩慢，這是由于菌體接入新環(huán)境后有一定的延遲期所致，2h 后經(jīng)乳糖酶處理的樣品pH 由6.45 下降至6.18，而未經(jīng)乳糖酶處理的樣品pH 由6.45 下降至6.32，經(jīng)乳糖酶處理的樣品的發(fā)酵速度比未經(jīng)乳糖酶處理的樣品的發(fā)酵速度略快。發(fā)酵2h 后，經(jīng)乳糖酶處理的樣品pH 急速下降，而未經(jīng)乳糖酶處理的樣品發(fā)酵3h 后pH 下降速率才有所增強(qiáng)。乳酸菌利用乳糖的過程可以分為兩個階段，第一個階段是乳酸菌自身分泌少量的乳糖酶，將乳糖分解成葡萄糖和半乳糖;第二個階段是乳酸菌利用葡萄糖或者半乳糖進(jìn)行糖酵解［11］。在普通酸奶中，由于前期菌體數(shù)量較少，自身分泌的乳糖酶量較少;在低乳糖酸奶中，由于利用外源乳糖酶對乳糖進(jìn)行水解，使得牛乳中存在大量的葡萄糖和半乳糖，而葡萄糖作為最直接能量供應(yīng)單位而被乳酸菌直接利用，因此，與未經(jīng)乳糖酶處理組相比，經(jīng)乳糖酶處理的樣品在發(fā)酵前期產(chǎn)酸更快，宏觀表現(xiàn)為pH 下降更劇烈。

2.2 貯藏期間發(fā)酵乳酸度的變化

牛乳經(jīng)發(fā)酵10h 后攪拌3min，4℃貯藏，低乳糖酸奶與普通酸奶的酸度在保質(zhì)期內(nèi)的變化如圖2所示。

由圖2 可知，在貯藏過程中，低乳糖酸奶和普通酸奶均有顯著的后酸化，其中低乳糖酸奶的酸度由85°T 上升到112°T，上升了27°T，普通酸奶的酸度由76°T 上升到110°T，上升了34°T。雖然發(fā)酵結(jié)束時低乳糖酸奶的酸度比普通酸奶號高9°T，但在貯藏一段時間后酸度幾乎相當(dāng)，這與早期徐雅琴等研究的低乳糖酸奶數(shù)據(jù)相吻合［6］。酸乳在貯藏過程中，乳酸菌繼續(xù)生長繁殖消耗殘存的乳糖，半乳糖，葡萄糖，蔗糖產(chǎn)生乳酸導(dǎo)致酸度進(jìn)一步升高。在貯藏前期，普通酸奶的后酸化速度比低乳糖酸奶快，這可能與乳酸菌生長至一定數(shù)量后自身乳糖酶分泌量增大，水解出足量葡萄糖加快了其新陳代謝的速度;而經(jīng)乳糖酶處理的樣品在葡萄糖逐漸耗盡后開始利用半乳糖和蔗糖新陳代謝放慢。低乳糖酸奶和普通酸奶在貯藏后期酸度逐漸趨于穩(wěn)定，這可能與菌體處于衰退期自身產(chǎn)酸很弱，或部分菌體裂解后釋放出的蛋白質(zhì)被降解成堿性氨基酸有關(guān)［12］。

圖2 樣品在貯藏期間酸度的變化Fig.2 Changes of samples acidity in shelf life

2.3 貯藏期間發(fā)酵乳黏度的變化

圖3 為低乳糖酸奶和普通酸奶在4℃貯藏條件下黏度變化情況。從圖3 可以看出，在貯藏期間2 種酸奶的黏度顯著增大，其中普通酸奶由469mPa·s 上升到628mPa·s，上升了159mPa·s，低乳糖酸奶由503mPa·s 上升到675mPa·s，上升了172mPa·s。酸乳黏度主要由蛋白質(zhì)在酸性條件下發(fā)生變性沉淀和乳酸菌代謝產(chǎn)生的具有黏性的胞外多糖共同組成［13］，是酸奶的一個重要指標(biāo)，李全陽等通過對攪拌型酸奶流變學(xué)特性的研究認(rèn)為，一般的酸奶測定黏度在400mPa·s 以上就具有較好的入口黏度［14-15］，低乳糖酸奶在發(fā)酵終點(diǎn)時黏度比普通酸奶高34mPa·s，這可能與低乳糖酸奶中由于乳糖酶水解的作用，牛乳中葡萄糖含量較高，乳酸菌在前期利用葡萄糖產(chǎn)生更多的胞外多糖有關(guān)［16］。

圖3 樣品在貯藏期間黏度的變化Fig.3 Changes of samples viscosity in shelf life

2.4 貯藏期間發(fā)酵乳中活菌含量的變化

低乳糖酸奶和普通酸奶在4℃貯藏過程中乳酸菌數(shù)量變化如圖4 所示。從圖4 可以看出，在貯藏期間，乳酸菌數(shù)量都有明顯的先上升后下降趨勢，低乳糖酸奶中乳酸菌數(shù)量略高于普通酸奶。低乳糖酸奶中乳酸菌數(shù)量在10d 后開始呈下降趨勢，而普通酸奶在15d 后開始呈下降趨勢，這可能與低乳糖酸奶中前期產(chǎn)生的乳酸較多，pH 較低有關(guān)。隨著貯藏時間的延長，酸乳酸度的進(jìn)一步提高，活菌數(shù)逐漸下降，25d 后普通酸奶中活菌數(shù)量已下降至1.4 ×108cfu/g，但活菌數(shù)仍高于國家標(biāo)準(zhǔn)的最低限(≥106cfu/mL)。酸乳在貯藏過程中，隨著乳酸菌進(jìn)一步的新陳代謝，乳酸含量逐漸升高，pH 逐漸下降，菌體的生長受到其代謝產(chǎn)物的抑制，同時菌株老化，死亡數(shù)增多，故逐漸出現(xiàn)活菌數(shù)量上的下降［17］。

2.5 貯藏期間發(fā)酵乳中雙乙酰含量的變化

低乳糖酸奶和普通酸奶在4℃貯藏期間雙乙酰含量變化見圖5，由圖5 可知，低乳糖酸奶中的雙乙酰含量顯著高于普通酸奶。其中，低乳糖酸奶中雙乙酰含量由11.4mg/L 增加至13.6mg/L，普通酸奶中雙乙酰含量由10.6mg/L 增加至12.7mg/L，酸乳中雙乙酰含量都隨時間的延長而升高，這亦說明酸奶隨著貯藏時間的延長風(fēng)味會更加濃厚，貯藏一段時間飲用風(fēng)味更佳。乳酸菌發(fā)酵過程中，丁二酮由代謝中間產(chǎn)物α-乙酰乳酸經(jīng)氧化脫羧產(chǎn)生，為初級代謝產(chǎn)物，因此在前期菌體代謝旺盛時合成較多，而在4℃冷藏期間增加量不大［18］。

圖4 樣品在貯藏期間乳桿菌活菌數(shù)的變化Fig.4 Changes of samples viable cell numbers of Lactobacillus in shelf life

圖5 樣品在貯藏期間雙乙酰含量的變化Fig.5 Changes of samples contend of diacetyl in shelf life

2.6 貯藏期間發(fā)酵乳中乙醛含量的變化

圖6 為低乳糖酸奶和普通酸奶在4℃貯藏條件下隨時間延長乙醛含量變化情況，由圖6 可知，隨著時間的延長，低乳糖酸奶與普通酸奶中乙醛的含量均顯著提高，其中低乳糖酸奶中乙醛含量由17.1mg/L 上升到20.5mg/L，普通酸奶中乙醛含量由16.5mg/L 上升到19.6mg/L，低乳糖酸奶增幅略高于普通酸奶。在酸乳發(fā)酵期間，乙醛由丙酮酸脫羧酶或丙酮酸氧化酶催化直接產(chǎn)生，也可先由丙酮酸脫氫酶催化生成中間產(chǎn)物乙酰輔酶A 間接產(chǎn)生;低乳糖酸奶在前期發(fā)酵產(chǎn)生更多的中間產(chǎn)物，因此乙醛含量較普通酸奶更高［18-19］。

圖6 樣品在貯藏期間乙醛含量的變化Fig.6 Changes of samples contend of acetaldehyde in shelf life

3 結(jié)論

本文對低乳糖酸奶與普通酸奶在發(fā)酵過程中pH 的變化及發(fā)酵乳在4℃貯藏期間酸度、黏度、活菌數(shù)含量、主要風(fēng)味物質(zhì)雙乙酰和乙醛變化進(jìn)行了比較，結(jié)果表明低乳糖酸奶在發(fā)酵過程中發(fā)酵更快，貯藏過程中酸度變化更小，而且黏度、活菌數(shù)、風(fēng)味物質(zhì)含量均高于普通酸奶。低乳糖酸奶與普通酸奶相比具有更高的品質(zhì)，更具市場前景。

乳糖不耐癥一直影響著消費(fèi)者對牛乳及乳制品的需求。雖然近幾年隨著乳業(yè)技術(shù)的提升，低乳糖巴氏奶、低乳糖UHT 奶、低乳糖奶粉相繼被開發(fā)出來并逐漸被消費(fèi)者接受，但其乳糖的含量仍無法滿足乳糖不耐癥嚴(yán)重的人群;低乳糖酸奶通過乳糖酶與乳酸菌發(fā)酵相結(jié)合進(jìn)一步降低了酸奶中乳糖的含量，豐富了乳制品市場，相信隨著乳業(yè)技術(shù)的發(fā)展，乳糖不耐受將會得到根本性解決。

［1］Davidson G P，Goodwin D，Robb T A.Incidence and duration of lactose malabsorption in children hospitalized with acute enteritis： study in a well-nourished urban population［J］.The Journal of Pediatrics，1984，105(4) ：587-590.

［2］ Nagaraj M，Sharanagouda B，Manjunath H，et al.Standardization of different levels of lactose hydrolysis in the preparation of lactose hydrolyzed yogurt［J］.Iranian Journal of Veterinary Research，Shiraz University，2009，10(2) ：132-136.

［3］Jeanette N K，Jill N，Alan R，et al.The prevalence of selfreported Lactose Intolerance and the consumption of dairy foods among african american adults are less than expected［J］.Journal of the National Medical Association，2011，103(1) ：36-45.

［4］Daniel L，Swagerty Jr，Anne D，et al.Lactose intolerance［J］.American Family Physician，2002，65(9) ：1845-1850.

［5］Ibarra A，Acha R，Callahan M T，et al.Optimization and shelf life of a low-lactose yogurt with Lactobacillus rhamnosus HN001［J］.Journal of Dairy Science，2012，95(7) ：3536-3548.

［6］徐雅琴，馮大偉.中性乳糖酶Maxilact 對酸奶感官品質(zhì)和發(fā)酵過程的影響.中國食品添加劑［J］，2009，1：81-84.

［7］張水華.食品分析［M］.北京：中國輕工業(yè)出版社，2004.

［8］凌代文.乳酸菌分類鑒定及實驗方法［M］.北京：中國輕工業(yè)出版社，1999.

［9］呂嘉櫪，李成濤.酸奶中雙乙酰含量的測定方法初探［J］.中國乳品工業(yè)，2006，34(1) ：21-22.

［10］李妍，邢慧敏，邵亞東，等.發(fā)酵乳中丁二酮和乙醛含量檢測方法探討［J］.分析與檢測，2008，34(3) ：157-159.

［11］郭本恒.益生菌［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2004.

［12］郭清泉，張?zhí)m威，林淑英.酸奶發(fā)酵機(jī)理及后酸化控制措施［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2001，27(2) ：80-83.

［13］ Skriver A，Roemer R H，Qvist K B. Rheological characterization of stirred yoghurt： viscometry［J］. Journal of Texture Study，1993，24：185-190.

［14］李全陽，夏文水.酸乳中乳酸菌所產(chǎn)胞外多糖特性的初步研究［J］.食品科學(xué)，2009，25(2) ：80-84.

［15］徐成勇，郭本恒，鄭思聰，等.弱后酸化酸奶發(fā)酵劑的篩選［J］.中國乳品工業(yè)，2007，35(3) ：12-16.

［16］Andre R M，Ricardo L M，Janaina F M，et al.Simultaneous enzymatic hydrolysis and lactic fermentation to obtain a yogurt with lactose content［J］.Food Scinece and Technology，2012，36(5) ：551-559.

［17］尚玉琳，孟祥晨.不同酸奶發(fā)酵劑的發(fā)酵性能比較［J］.食品科技，2011，36(10) ：41-45.

［18］Hugenholtz J，Sybesma W，Nierop G M，et al.Metabolic engineering of Lactic acid bacteria for the production of nutraceuticals［J］.Antonie Leeuwenhoek，2002，82：217-235.

［19］韓希妍，孫大慶，相麗，等.乳酸菌風(fēng)味代謝物質(zhì)的基因調(diào)控［J］.微生物學(xué)報，2007，47(6) ：1105-1109.