張雅麗，李建科 ，劉 柳

( 陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西西安710062)

沒(méi)食子酸(Gallic acid)，為3，4，5-三羥基苯甲酸，分子式為C7H6O5，分子量為170.12，通常以一水合物的狀態(tài)存在，是白色或微黃色針狀晶體，是一種天然的多酚類(lèi)化合物。它以游離酸形式或形成酯類(lèi)化合物存在于五倍子、茶、沒(méi)食子等植物中，是植物體中一類(lèi)次生代謝產(chǎn)物，屬于低毒物質(zhì)，可用于醫(yī)藥、有機(jī)合成和食品、農(nóng)業(yè)、礦產(chǎn)等領(lǐng)域［1］。食品是人類(lèi)生存的基礎(chǔ)物質(zhì)，隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展、生活水平的提高，人們?cè)絹?lái)越重視對(duì)食品污染菌的控制。國(guó)內(nèi)外對(duì)沒(méi)食子酸的生物活性研究涉及抗氧化、抗腫瘤、抗突變等［2-4］。有報(bào)道證實(shí)［5］沒(méi)食子酸在體外對(duì)金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門(mén)菌等具有很好的抑制作用，但從食品安全角度對(duì)其抑菌作用的研究報(bào)道少且不系統(tǒng)。本文以食品中常見(jiàn)食源性致病菌和腐敗菌為供試菌，研究了沒(méi)食子酸的體外抑菌活性，并通過(guò)掃描電鏡觀察了高敏感菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化，為沒(méi)食子酸抑菌機(jī)制的深入研究及應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大腸桿菌(Escherichia coli)，金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，單增李斯特菌(Listeria monocytogenes)，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtillis)，蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)，巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)，以上菌株均由陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院功能食品與安全實(shí)驗(yàn)室提供;蛋白胨、酵母浸粉、瓊脂均為國(guó)產(chǎn)生化試劑;氯化鈉、氫氧化鈉、沒(méi)食子酸(一水)均為國(guó)產(chǎn)分析純。

LDZX-30KBS 立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠;SPX 智能型生化培養(yǎng)箱 寧波江南儀器廠;THZ-D 型臺(tái)式恒溫震蕩器 太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠;680 型酶標(biāo)儀 美國(guó)伯樂(lè)公司;YJ-HS-1 單人水平型潔凈工作臺(tái) 蘇凈集團(tuán)安泰公司;牛津杯 內(nèi)徑(6.0 ±0.1)mm，外徑(7.8 ±0.1)mm;Quanta200 型環(huán)境掃描電子顯微鏡 FEI 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

表1 沒(méi)食子酸對(duì)各菌的最小抑菌濃度Table 1 The minimal inhibitory concentration of Gallic acid on different pathogens

1.2.1 LB 培養(yǎng)基［6］液體培養(yǎng)基:蛋白胨1g、酵母浸粉0.5g、氯化鈉1g，蒸餾水100mL，調(diào)pH7.3;固體培養(yǎng)基中加2g 瓊脂粉，其它同上;121℃高壓滅菌20min。

1.2.2 活化菌種及制備菌懸液［7］將保存在試管斜面培養(yǎng)基上的菌種，通過(guò)劃線法接種于LB 固體平板上，37℃培養(yǎng)24h，連續(xù)培養(yǎng)兩代;取活化后的單菌落接種于5mL LB 液體培養(yǎng)基中，37℃、110r/min 培養(yǎng)16h，并以LB 液體培養(yǎng)基稀釋菌液濃度為105CFU/mL作為供試菌菌懸液，備用。

1.2.3最小抑菌濃度 (minimal inhibitory concentration，MIC)的測(cè)定［8］采用液體二倍稀釋法，用LB 液體培養(yǎng)基將沒(méi)食子酸制成終濃度分別為4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625mg/mL 的溶液;各取5mL 做為實(shí)驗(yàn)組，以不加沒(méi)食子酸的LB 培養(yǎng)基為對(duì)照組，分 別 加 入 200μL 供 試菌 菌 懸 液，37℃、110r/min培養(yǎng)24h，以肉眼觀察，沒(méi)有變渾濁的最低濃度為沒(méi)食子酸對(duì)該菌的最小抑菌濃度，每組重復(fù)3 次。

1.2.4 抑菌活性測(cè)定［9］采用牛津杯法。取各供試菌菌懸液200μL 于對(duì)應(yīng)瓊脂平板上，涂布均勻，每個(gè)平板上放2 個(gè)牛津杯，一個(gè)加入200μL 沒(méi)食子酸溶液，另一個(gè)加LB 液體培養(yǎng)基作為對(duì)照組。將平板置于37℃恒溫培養(yǎng)24h 后測(cè)抑菌圈直徑，每組重復(fù)3次，取平均值。

1.2.5 對(duì)生長(zhǎng)曲線的影響［10］用LB 液體培養(yǎng)基將沒(méi)食子酸制成終濃度分別為1/2MIC、1 倍MIC 的溶液，各取5mL 做為實(shí)驗(yàn)組，以不加沒(méi)食子酸的LB 培養(yǎng)基為對(duì)照組，分別加入200μL 供試菌菌懸液，在37℃、110r/min 條件下連續(xù)培養(yǎng)，每隔2h 用酶標(biāo)儀測(cè)定OD630nm值，直到各菌生長(zhǎng)達(dá)到穩(wěn)定期，每組重復(fù)3 次，取平均值，制作OD630nm-t 生長(zhǎng)曲線。

1.2.6 用掃描電鏡觀察對(duì)單增李斯特菌形態(tài)的影響［11］以加入1 倍MIC 濃度的沒(méi)食子酸組為實(shí)驗(yàn)組，以不加沒(méi)食子酸的為對(duì)照組。兩組各取5mL，分別加200μL 單增李斯特菌菌懸液，37℃、110r/min 培養(yǎng)12h，隨后按以下步驟分別處理實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組。在4000r/min 離心10min 收集菌體，在2.5%戊二醛溶液中4℃固定過(guò)夜，0.2mol/L pH7.2 磷酸鹽緩沖液洗兩次以洗去殘存的戊二醛，分別用40%、70%、90%、100%(v/v)不同濃度的乙醇對(duì)菌體進(jìn)行脫水處理各15min，然后將菌體涂在載玻片上，自然晾干，噴金，用掃描電鏡進(jìn)行觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌效果的研究

由表1 可知，沒(méi)食子酸對(duì)供試菌都有抑制效果。對(duì)單增李斯特菌的抑菌效果最好，MIC 為0.125mg/mL;對(duì)大腸桿菌次之，MIC 為0.25mg/mL;對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌的效果較弱，MIC 分別為2、4、4、4mg/mL。最小抑菌濃度可作為評(píng)價(jià)抑菌物質(zhì)體外抑菌活性強(qiáng)弱的指標(biāo)，MIC 值越小，說(shuō)明該物質(zhì)對(duì)此菌的抑制能力越強(qiáng)。許維國(guó)等［5］研究結(jié)果顯示沒(méi)食子酸對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、腸炎沙門(mén)菌、鼠傷寒沙門(mén)菌具有抑制作用，尤其對(duì)鼠傷寒沙門(mén)菌效果好。鄭曙明等［1］研究了沒(méi)食子酸對(duì)柱狀黃桿菌、溫和氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌和遲緩愛(ài)德華菌4 種水產(chǎn)動(dòng)物致病菌的體外抑菌作用，其中遲緩愛(ài)德華菌表現(xiàn)出較高的敏感性。本實(shí)驗(yàn)所用供試菌雖與上述研究中的不完全相同但都表明沒(méi)食子酸具有很好的抑菌作用。

2.2 抑菌活性的研究

由表2 可知，沒(méi)食子酸對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌、枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌6 種菌的抑菌圈直徑分別為20.67 ±0.28、17.17 ±0.64、24.03 ±0.17、14.43 ±0.10、14.77 ±0.04、(15.07 ±0.03)mm。各菌均對(duì)沒(méi)食子酸表現(xiàn)出不同的敏感性，其中單增李斯特菌最敏感、抑菌圈最大，大腸桿菌次之。因此在后面實(shí)驗(yàn)中，本文只用掃描電鏡觀察了沒(méi)食子酸對(duì)高敏感菌單增李斯特菌形態(tài)的影響。并且沒(méi)食子酸對(duì)枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌所產(chǎn)生的抑菌圈略有差異，3者中巨大芽孢桿菌抑菌圈最大。

表2 沒(méi)食子酸對(duì)各菌的抑菌活性Table 2 The antibacterial activity of Gallic acid on different pathogens(mm)

2.3 對(duì)生長(zhǎng)曲線的影響的研究

細(xì)菌懸液的光密度可反映出細(xì)菌濃度的大小，并進(jìn)一步體現(xiàn)細(xì)菌的生長(zhǎng)情況。如圖1～圖6 所示，對(duì)照組均呈現(xiàn)細(xì)菌典型的生長(zhǎng)曲線，而加入1 倍MIC和1/2MIC 濃度的沒(méi)食子酸后，細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線均有不同程度的改變。圖1 中，1 倍MIC 濃度處理組中，大腸桿菌生長(zhǎng)緩慢，與對(duì)照組相比，沒(méi)食子酸主要抑制了其對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌體分裂;而1/2MIC 濃度處理組中菌體雖進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，但由于沒(méi)食子酸的抑制作用，其OD630nm值小于對(duì)照組。圖2～圖6 中，1 倍MIC 濃度處理組中，各菌生長(zhǎng)曲線都處于較低狀態(tài)，但金黃色葡萄球菌在14h 后出現(xiàn)生長(zhǎng)現(xiàn)象，可能是由于沒(méi)食子酸被逐漸消耗，致使抑制效果持續(xù)時(shí)間短［10］，而蠟狀芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌都能被很好的抑制;1/2MIC 濃度處理組中各菌體在沒(méi)食子酸作用下OD630nm值均小于對(duì)照組。圖3 中，經(jīng)1 倍MIC 濃度處理的單增李斯特菌生長(zhǎng)緩慢，不能進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期;而1/2MIC 濃度處理組中，菌體在10h 前生長(zhǎng)緩慢，此后迅速生長(zhǎng)，可能與沒(méi)食子酸濃度低有關(guān)［12］。

圖1 沒(méi)食子酸對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effect of Gallic acid on Escherichia coli growth

圖2 沒(méi)食子酸對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的影響Fig.2 Effect of Gallic acid on Staphylococcus aureus growth curve

2.4 掃描電鏡觀察對(duì)單增李斯特菌形態(tài)影響的結(jié)果

由圖7 可知，未經(jīng)處理的對(duì)照組中A 單增李斯特菌形態(tài)完整、兩端圓鈍，呈現(xiàn)桿狀，并且表面圓潤(rùn)、光滑，較分散，細(xì)胞間邊界明顯;而實(shí)驗(yàn)組B 中，菌體從中間處凹陷，大部分出現(xiàn)破損，具有明顯的細(xì)胞原生質(zhì)泄漏現(xiàn)象，致使細(xì)胞結(jié)成一團(tuán)?？梢?jiàn)沒(méi)食子酸對(duì)菌體細(xì)胞具有損傷破壞作用，但是不能明確說(shuō)明沒(méi)食子酸與菌體細(xì)胞的結(jié)合位點(diǎn)，這有待進(jìn)一步研究。

圖3 沒(méi)食子酸對(duì)單增李斯特菌生長(zhǎng)的影響Fig.3 Effect of Gallic acid on Listeria monocytogenes growth curve

圖4 沒(méi)食子酸對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響Fig.4 Effect of Gallic acid on Bacillus subtillis growth curve

圖5 沒(méi)食子酸對(duì)蠟狀芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響Fig.5 Effect of Gallic acid on Bacillus cereus growth curve

圖6 沒(méi)食子酸對(duì)巨大芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響Fig.6 Effect of Gallic acid on Bacillus megaterium growth curve

3 討論

圖7 沒(méi)食子酸對(duì)單增李斯特形態(tài)的影響(A 對(duì)照組，B 實(shí)驗(yàn)組)Fig.7 Effect of Gallic acid on the cells of Listeria monocytogenes(A control group，B experimental group)

3.1 從抑菌作用上看，沒(méi)食子酸在體外對(duì)各供試菌均有較好的抑制作用。有研究顯示，茶多酚產(chǎn)生抑菌作用的分子結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)主要是酚羥基［13］。沒(méi)食子酸分子結(jié)構(gòu)中含有3 個(gè)毗鄰的酚羥基，因此酚羥基可能是沒(méi)食子酸產(chǎn)生抑菌作用的活性基團(tuán)。

3.2 掃描電鏡觀察沒(méi)食子酸對(duì)單增李斯特菌形態(tài)影響的結(jié)果顯示，菌體大部分出現(xiàn)破損，細(xì)胞原生質(zhì)泄漏。耿飛等［14］研究烏梅提取液對(duì)單增李斯特菌的抑菌機(jī)理時(shí)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)1 倍MIC 濃度的烏梅提取液處理過(guò)的單增李斯特菌，細(xì)胞膜電位降低、胞內(nèi)Ca2+濃度下降，證實(shí)烏梅提取液可作用于單增李斯特菌的細(xì)胞膜系統(tǒng)，使其細(xì)胞膜裂解、內(nèi)容物泄漏。并且Sitohy 等［15］用透射電鏡觀察大豆球蛋白對(duì)單增李斯特菌的影響，發(fā)現(xiàn)被處理過(guò)的菌體變形、細(xì)胞膜破損。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述兩者相似，說(shuō)明沒(méi)食子酸可能作用于單增李斯特菌的細(xì)胞膜，使其裂解，進(jìn)而胞內(nèi)物質(zhì)外泄導(dǎo)致菌體死亡。

4 結(jié)論

沒(méi)食子酸對(duì)6 種食品中常見(jiàn)食源性致病菌和腐敗菌在體外具有很好的抑制作用，對(duì)單增李斯特菌抑制作用最好;不同濃度沒(méi)食子酸對(duì)各菌生長(zhǎng)曲線都有影響，其OD630nm值均小于對(duì)照組，并且濃度增大產(chǎn)生抑制作用增強(qiáng)。掃描電鏡觀察沒(méi)食子酸對(duì)高敏感菌單增李斯特菌形態(tài)影響的結(jié)果顯示，沒(méi)食子酸可使菌體從中間處凹陷、大部分出現(xiàn)破損、細(xì)胞原生質(zhì)泄漏。綜上所述，沒(méi)食子酸在體外具有很好的抑菌作用，期望為沒(méi)食子酸的深入開(kāi)發(fā)和利用及其抑菌機(jī)制的研究提供理論基礎(chǔ)，以使其發(fā)揮更大的作用。

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