郭明遺，霍丹群，* ，侯長(zhǎng)軍，王洪彬，唐玉明，任道群，鄧 波，盧中明，

(1.重慶大學(xué)生物工程學(xué)院，重慶400044;2.四川省瀘州市釀酒科學(xué)研究所，四川瀘州646000;3.國(guó)家固態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心，瀘州老窖股份有限公司，四川瀘州646000)

我國(guó)釀酒歷史悠久，工藝獨(dú)特，在世界釀酒史上獨(dú)樹一幟。中國(guó)白酒年銷售收入上千億元，濃香型白酒屬于中國(guó)白酒四大香型之一，其產(chǎn)量在幾大香型白酒中名列前茅，其銷售量占全國(guó)白酒總量的70%左右［1］。己酸乙酯是濃香型白酒中最重要的主體香味成分，其含量高低與酒的風(fēng)味和質(zhì)量密切相關(guān)。利用微生物的酯化功能來(lái)提高酒中酯含量的研究與應(yīng)用是近年來(lái)釀酒行業(yè)的熱點(diǎn)［2-5］。紅曲霉是非常重要的釀酒有益菌群，按真菌學(xué)的分類方法，紅曲霉錄屬于真菌門(Eumycophyta)，子囊菌綱(Ascomycetes)，真子囊菌亞綱(Euascomycetes)，散子囊菌目(Eurotiales)，紅曲菌科(Monascaceae)，紅曲霉屬(Monascus)［6］，所產(chǎn)酯化酶具有較強(qiáng)的催化己酸乙酯合成能力，是濃香型白酒釀造中一類重要的酯香菌種［7-8］。老窖出好酒，原因之一是釀酒微生物經(jīng)長(zhǎng)期馴化后，優(yōu)良釀酒特性得到了很好的積淀和增強(qiáng)。傳統(tǒng)的釀酒微生物分類鑒定主要集中在觀察其形態(tài)和習(xí)性的水平，生理生化特征、培養(yǎng)特征、生態(tài)特征等方法［9-12］。使得中國(guó)傳統(tǒng)固態(tài)釀酒微生物研究水平尚低，釀酒機(jī)理研究解釋不足。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的深入發(fā)展及其在分類鑒定中的應(yīng)用［13-18］，如DNA 信息分析法(尤其是ITS(ITS1-5.8SrDNAITS2))分析［19-23］，依托功能強(qiáng)大的生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)，利用計(jì)算機(jī)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，自動(dòng)化和標(biāo)準(zhǔn)化程度高，大大簡(jiǎn)化了鑒定程序，為菌株的快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便鑒定、以及利用提供了新型研究手段，將從根本上提升釀酒微生物菌種的分類鑒定與菌株區(qū)分，從而提升傳統(tǒng)行業(yè)的科技水平，推動(dòng)發(fā)酵工業(yè)領(lǐng)域發(fā)展。本研究對(duì)得到的優(yōu)良釀酒功能菌分類鑒定，酶學(xué)特性分析，以期對(duì)具有中國(guó)傳統(tǒng)特色的白酒釀造窖池中的微生物資源進(jìn)行挖掘與保護(hù)，為進(jìn)一步研究功能菌、利用功能菌、優(yōu)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酯化功能菌LZLJ 2103，分離篩選自瀘州老窖“1573 國(guó)寶窖池”。經(jīng)實(shí)際應(yīng)用生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)，顯示具有較強(qiáng)的己酸乙酯酯化能力，酯化力約為目前生產(chǎn)用低溫曲和次高溫曲的2.1 倍、高溫曲的12.5 倍。

MyCycler PCR 儀 美 國(guó) Bio - Rad 公 司;GelDocXR 核酸/蛋白凝膠圖像分析管理系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad 公司;GenomeLab GeXP(測(cè)序)分析系統(tǒng) 美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司;VEGA3 XMH 掃描電子顯微鏡 捷克TESCAN 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌體培養(yǎng) 麥芽汁瓊脂(Wa)培養(yǎng)基，30℃，平皿培養(yǎng)7d，觀察菌絲體及菌落形態(tài)。麥芽汁培養(yǎng)基，30℃，120r/min，培養(yǎng)4d，過(guò)濾收集菌絲，用PBS 緩沖液沖洗3 次，紗布吸干殘余水分，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 形態(tài)觀察 平板培養(yǎng)，對(duì)菌落整體特征進(jìn)行觀察鑒定。并挑取培養(yǎng)后長(zhǎng)勢(shì)良好的菌絲體，固定于潔凈的硅片上，真空冷凍干燥，鍍金［24］，采用VEGA3 TESCAN 掃描電子顯微鏡觀察。

1.2.3 總酯的皂化法測(cè)定 取50.00mL 樣液于250mL 回流瓶中，加兩滴酚酞指示劑，以NaOH 標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液滴定至粉色，記錄消耗NaOH 標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的毫升數(shù)。再準(zhǔn)確加入NaOH 標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液25.00mL，搖勻，放入3 顆沸石，裝上冷凝管，于沸水浴上回流30min，取下，冷卻。將樣液移入100mL 燒杯中，用10mL 水分次沖洗回流瓶，洗液并入燒杯。插入電極，放入一枚轉(zhuǎn)子，置于電磁攪拌器上，開始攪拌，滴加硫酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液，當(dāng)pH9.00 后，放慢滴定速度，每次滴加半滴溶液直至pH8.70 為其終點(diǎn)，記錄消耗硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積。同時(shí)，吸取乙醇(無(wú)酯)溶液50.00mL，按同樣操作做空白實(shí)驗(yàn)。計(jì)算出總酯含量。

1.2.4 酯化酶活力的測(cè)定 取25mL 酶液，加0.3mL己酸、3mL 無(wú)水乙醇、1.7mL 純水(pH7.0)，37℃酯化7d，采用皂化法測(cè)定總酯［25］，計(jì)算出酶活力。

1.2.5 菌株所產(chǎn)酯化酶最適溫度的測(cè)定 設(shè)定反應(yīng)溫度為10、20、30、40、50、60℃溫度梯度。測(cè)定不同溫度下的酶活力，以確定最適作用溫度。以最高酶活為對(duì)照記做100%。(每個(gè)梯度設(shè)置3 組重復(fù))

1.2.6 菌株所產(chǎn)酯化酶最適pH 的測(cè)定 采用磷酸鹽(磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖體系、磷酸二氫鈉-磷酸二氫鉀緩沖體系)，調(diào)節(jié)酶液與底物反應(yīng)體系pH 分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，于最適作用溫度下，測(cè)定不同pH 下的酶活力，以確定最適作用pH。以最高酶活為對(duì)照記做100%。

1.2.7 金屬離子對(duì)菌株所產(chǎn)酯化酶活力的影響 在酶液中添加Na+、K+、Ca2+、Fe2+、Cu2+、Mg2+各金屬離子，使體系中各金屬離子終濃度為1mmol·L-1，最適溫度、pH 條件下，測(cè)定酶活性。以未加金屬離子的酶活性為100%，比較得出金屬離子的影響程度。

1.2.8 菌絲體基因組DNA 的提取及ITS 序列擴(kuò)增 取菌絲體，液氮研磨后，采用改進(jìn)的氯化芐法［26］提取基因組DNA，PCR 擴(kuò)增ITS(ITS1-5.8SrDNA-ITS2)序列，1.5% 瓊脂糖凝膠200V、15min 電泳，Glodview核酸染料染色紫外檢測(cè)。擴(kuò)增引物:通用引物ITS1 primer(5' - TCCGTAGGTGAACCTGCGG - 3')、ITS4 primer(5'- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')。PCR反應(yīng)體系(25μL):DNA 模板3.0(L、10(PCR buffer 2.5μL、d-NTP mix 1.0μL 上游引物0.5μL、下游引物0.5μL、Tap 聚合酶0.5μL、雙蒸水17.0μL。反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性5min;94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，35 個(gè)循環(huán);72℃補(bǔ)平10min。

1.2.9 序列測(cè)定、比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育分析 純化后的PCR 產(chǎn)物，經(jīng)TA 克隆后，采用GenomeLab GeXP 分析系統(tǒng)測(cè)序。對(duì)測(cè)得的供試菌的ITS 序列，用NCBI GeneBank 數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST 工具軟件在DNA 序列數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索同源DNA 序列進(jìn)行比對(duì)分析，選取與供試菌株親緣關(guān)系相近的代表菌株用ClustalX2.0 和DNAMAN 軟件進(jìn)行比對(duì)分析，用Mega5 軟件構(gòu)建NJ(Neighbor-joining)系統(tǒng)樹，同時(shí)采用DNAstar 軟件進(jìn)行系列間距離系數(shù)的計(jì)算。

2 結(jié)果與討論

2.1 培養(yǎng)性狀及形態(tài)特征

在Wa 培養(yǎng)基上，30℃，7d 菌落直徑12～22mm，平坦，稀疏至豐厚，表面質(zhì)地呈叢卷毛狀，淡玫瑰粉色［27］，有輻射紋;氣生菌絲體初白色隨菌落成熟而變成粉紅色，絮狀;菌絲不規(guī)律地分枝，寬度3～5μm，個(gè)別菌絲粗壯，菌絲體頂端著閉囊殼，直徑15～30μm，分子孢子罕見(jiàn)，子囊孢子無(wú)色、卵形;菌落表面具有小而清楚的橙色滲出液;正反面具有差別，背面褶皺，燕頷紅［26］。

2.2 PCR 產(chǎn)物克隆測(cè)序結(jié)果

測(cè)得ITS 序列長(zhǎng)度為579bp，提交NCBI 中的GeneBank 獲得Accession number 為JN869464，詳細(xì)序列信息為 Internal transcribed spacer 1 + 5.8S ribosomal RNA gene +Internal transcribed spacer 2，其序列如下:

圖1 LZLJ 2103 菌株菌落形態(tài)Fig.1 Colonial morphology of LZLJ 2103

圖2 LZLJ 2103 菌株掃描電鏡圖譜Fig.2 Scanning electron micrograph of strain LZLJ 2103

2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

通過(guò)Blast 程序與GeneBank 中核酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果顯示LZLJ 2103(GenBank:JN869464)與紅曲霉屬M(fèi)onascus spp.普遍具有較高的同源性。篩選的Monascus 屬典型菌株用于系統(tǒng)發(fā)育分析(表1)。rDNA ITS 序列相似性＞95%，可初步鑒別為相同屬;序列相似性≥99.5%，可初步鑒定為相同種［28］。DNAstar 分析(圖3)顯示LZLJ 2103 ITS 序列與DQ978997.1 和HQ158608.1 相似性最高(≥99.5%)，離散度小于0.5%。(G +C)%含量分別為57.34%、57.17%、57.17%，三者間有3 個(gè)堿基的差異。同時(shí)，結(jié)合進(jìn)化樹(圖4)分析可以看出，該菌與HQ158608.1處于同一分支，與其發(fā)育關(guān)系最近。

表1 用于系統(tǒng)發(fā)育分析的典型菌種Table 1 Names and accession numbers of strains used for phylogenetic analysis

圖3 基于ITS 序列的距離矩陣Fig.3 Distance matrix of LZLJ 2103 based on sequence of ITS

圖4 基于ITS 序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree of LZLJ 2103 based on sequence of ITS

2.4 菌株所產(chǎn)酯化酶的酶學(xué)特性

2.4.1 最適作用溫度的測(cè)定 測(cè)定菌株LZLJ 2103 所產(chǎn)酯化酶與底物在不同反應(yīng)溫度下的酶活力，如圖5所示。表明該酯化酶在20～40℃時(shí)活力較高，在40℃時(shí)達(dá)到最高，為該酶最適作用溫度。(p ＜0.05)

2.4.2 最適作用pH 的測(cè)定 pH 可改變酶構(gòu)象，引起酶分子中活性中心結(jié)構(gòu)變化，從而改變酶活力。圖6 酶活力結(jié)果表明，在偏酸性環(huán)境下該酶活力較高，反應(yīng)的適宜pH 范圍為4.0～6.0，pH 為5.0 時(shí)，酶酯化活力最高。(p ＜0.05)

2.4.3 金屬離子的影響 金屬離子可以參與結(jié)合酶的活性部分，從而影響酶活。金屬離子對(duì)菌株所產(chǎn)酶化酶活力影響見(jiàn)圖7。結(jié)果顯示金屬離子Na+、K+、Mg2+、Fe2+對(duì)該酶有明顯的促進(jìn)作用，而Ca2+、Cu2+對(duì)該酶有抑制作用。

圖5 溫度對(duì)酶活力的影響Fig.5 Effect of temperature on esterifying activity of the crude esterase from LZLJ 2103

圖6 pH 對(duì)酶活力的影響Fig.6 Effect of pH on esterifying activity of the crude esterase from LZLJ 2103

圖7 金屬離子對(duì)酶活力的影響Fig.7 Effect of metal ions on esterifying activity of the crude esterase from LZLJ 2103

3 結(jié)論

優(yōu)良酯化功能菌LZLJ 2103 在麥芽汁瓊脂培養(yǎng)平皿上形成菌落形態(tài)特征與Monascus purpureus 類菌在麥芽汁培養(yǎng)基條件下的菌落特征相似［29］。對(duì)LZLJ 2103 的ITS 序列進(jìn)行分子解析，遺傳距離矩陣分析顯示，LZLJ 2103 與Monascus purpureus 類典型菌種具有較高的同源性，且進(jìn)化距離離散度為1%以下;同時(shí)進(jìn)化樹結(jié)果顯示處于同一分支。因此，根據(jù)形態(tài)學(xué)特征支持以及分子解析結(jié)果，基本可以判斷LZLJ 2103 菌株為Monascus 屬purpureus 種的一株新型優(yōu)良菌株，命名為Monascus purpureus LZLJ 2103。

菌株LZLJ 2103 所產(chǎn)酯化酶酶學(xué)特性研究表明，最適作用溫度為40℃;最適作用pH 為5.0;金屬離子Na+、K+、Mg2+、Fe2+對(duì)該酶有明顯的促進(jìn)作用，而Ca2+、Cu2+對(duì)該酶有抑制作用。無(wú)機(jī)離子是微生物生長(zhǎng)不可缺少的營(yíng)養(yǎng)元素，在制曲、發(fā)酵生產(chǎn)中，兼顧總體平衡下，適當(dāng)添加有益無(wú)機(jī)鹽，控制不利因素，積極為重要功能有益菌創(chuàng)造最適生長(zhǎng)條件和產(chǎn)酶條件，促進(jìn)酯化生香，可能將對(duì)提高發(fā)酵產(chǎn)品質(zhì)量方面提供積極的作用。

對(duì)該菌的鑒定和特性分析，為開發(fā)利用這一新型的發(fā)酵功能菌資源提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，能為生產(chǎn)應(yīng)用提供一定的指導(dǎo)。對(duì)酯化功能微生物的功能基因解析，調(diào)控模式分析，代謝通路的剖析等，有待進(jìn)一步研究。

［1］中國(guó)白酒市場(chǎng)投資分析及前景預(yù)測(cè)報(bào)告2009-2012.中國(guó)經(jīng)濟(jì)信息網(wǎng).http： //www.cei.gov.cn/.

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