姜琛璐，舒 暢，李 林

( 西南大學食品科學學院，重慶400715)

阪崎腸桿菌(Enterobacter sakazakii)是人和動物腸道內(nèi)寄生的一種革蘭陰性無芽孢桿菌，作為一種條件致病菌，它能夠引起嚴重的新生兒腦膜炎、菌血癥和壞死性小腸結腸炎，并能遺留嚴重的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，死亡率高達50%［1］。阪崎腸桿菌已被國際食品微生物標準委員會(International Commission for Microbiological Specifications for Foods，ICMSF)列入“對特定人群產(chǎn)生嚴重的生命危害、或產(chǎn)生慢性后遺癥”的微生物，與肉毒梭菌(Clostridium botalinum)的A、B 型毒素、單核細胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)等具有同等的危害［2］。雖然該菌在食品中的檢出率并不高，但其對嬰幼兒的嚴重危害已逐漸引起了國際關注。重慶市2010～2012年嬰幼兒食品中阪崎腸桿菌檢出率分別為0.00%、0.67%和3.33%，呈現(xiàn)明顯遞增趨勢。與其他食源性致病菌相比，阪崎腸桿菌的相關研究較少，這可能與其新興性有關。Nazarowec-White 等最早在1997 年研究了阪崎腸桿菌的溫度耐受性，鄭晶［3］等則研究了該菌在60℃和72℃(即巴氏殺菌溫度)下溫度耐受性，袁飛等則綜合研究了阪崎腸桿菌對溫度和強酸強堿的耐受性［4］。但之前的研究多集中于分析阪崎腸桿菌在殺菌溫度下的耐受性，而忽略了其在奶粉沖調(diào)溫度下的存活率，且對酸堿耐受性的考察也僅限于強酸強堿的單一pH。因此有必要擴大阪崎腸桿菌耐熱性、耐酸堿性的受試范圍，并結合耐藥性指導食品安全生產(chǎn)和感染病例的治療。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株 來自重慶市市售配方奶粉、米粉、面條等嬰幼兒食品中分離的8 株阪崎腸桿菌ES1～ES8，所有菌株均通過API 20E 和VITEK2 生化鑒定為ES;陽性對照菌株阪崎腸桿菌ATCC29544;藥敏質(zhì)控菌株大腸桿菌ATCC25922;阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基(OXOID);胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)培養(yǎng)基 北京陸橋;Mueller-Hinton 瓊脂 OXOID;藥敏試紙片OXOID，按美國國家臨床實驗室標準化委員會(the National Committee of Clinical Laboratory Standard，NCCLS)推薦的腸桿菌藥敏實驗抗生素選擇原則，并結合相關研究，選用包括萬古霉素等共10 大類19 種抗生素，名稱及濃度見表1。

表1 紙片擴散法測定阪崎腸桿菌耐藥性所用抗生素Table 1 Antibiotics used in the susceptibility testing of Enterobacter sakazakii by disk diffusion

濁度儀 美國HACH 公司;恒溫水浴箱 北京長風公司;高壓滅菌鍋 日本HIRIYAMA 公司;移液槍 法國GILSON 公司;孵箱 日本三機電國際貿(mào)易公司;游標卡尺 成都量具刃具股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 阪崎腸桿菌耐熱性實驗［3-4］將復蘇增殖的阪崎腸桿菌制成均勻的菌懸液，使其濃度控制在約107cfu/mL。將裝有10mL 滅菌生理鹽水的試管放入水浴鍋中進行升溫，平衡一段時間后，吸取1μL 的阪崎腸桿菌菌懸液加入試管中，使其分別在50、55、60、65℃水浴條件下處理1、2、3、5、8、10、20、30、60min 后取出。待冷卻至室溫后，搖勻，分別吸取處理后的菌液10μL，均勻涂布于TSA 培養(yǎng)基上，37℃倒置培養(yǎng)過夜后，觀察阪崎腸桿菌的生長情況。

1.2.2 阪崎腸桿菌耐酸堿性實驗［4］配制pH 分別為1.0、1.5、2.0、12.0、12.5、13.0 的生理鹽水，每只試管分裝10mL，滅菌后備用。將復蘇增殖的阪崎腸桿菌制成均勻的菌懸液，使其濃度控制在約107cfu/mL。取1μL 的阪崎腸桿菌菌懸液加入不同pH 的生理鹽水試管中，使其分別在pH1.0、1.5、2.0、12.0、12.5、13.0條件下處理0、30、60、90、120s。到達處理時間后立即搖勻，然后吸取10μL 菌液，均勻涂布于TSA 培養(yǎng)基上，37℃倒置培養(yǎng)過夜后，觀察阪崎腸桿菌的生長情況。

1.2.3 阪崎腸桿菌耐藥性實驗 采用NCCLS 推薦的紙片擴散法進行阪崎腸桿菌的藥敏實驗。從營養(yǎng)瓊脂上挑取單菌落于無菌生理鹽水中制成濁度為0.5個麥氏單位的菌懸液。用無菌棉拭子蘸取菌懸液均勻涂布于MH 瓊脂上，接種15min 內(nèi)用鑷子將藥敏試紙片均勻分布于90cm2平皿內(nèi)，每個平皿內(nèi)放置4 個試紙片。將平板置于36℃孵箱內(nèi)培養(yǎng)16～20h，取出后用游標卡尺測量讀取抑菌圈直徑，參照NCCLS 藥敏標準對腸桿菌科抑菌圈直徑的解釋標準進行結果判定。

2 結果與分析

2.1 阪崎腸桿菌的溫度耐受性

各菌株的耐熱性實驗結果如表2 所示。如表所示，當作用溫度為50℃時，除ES1、ES3、ES6 在60min作用后失活外，其他菌株均保持一定的活性;當作用溫度為55℃時，ES5 作用1min 后即失活，而ES2 在作用30min 后仍可存活，其余菌株基本在8min 后就可被滅活;當溫度為60℃時，僅ES2 能在前幾分鐘內(nèi)保持一定的活性，5min 后可被滅活;而當溫度升至65℃時，所有菌株均可被立即滅活。由此可見，9 株實驗菌株中，ES2 對溫度的耐受性最強，而ES5 的耐熱性較差。隨作用溫度的升高和作用時間的延長，所有菌株的活性均有不同程度的降低，為防止某些耐熱性較好菌株的存活，在生產(chǎn)和日常生活中至少應采用60℃作用5min 以上的條件對嬰幼兒食品和用具進行殺菌消毒。

2.2 阪崎腸桿菌的酸堿耐受性

結果顯示，所有實驗菌株在pH 為2.0、12.0、12.5下均可存活，但平皿上的菌落數(shù)量隨著作用時間的延長而減少。各菌株在pH 為1.0、1.5、13.0 下的存活情況有所差異，各菌株在pH 為1.0、1.5、13.0 下的存活情況如表3 所示。

如表3 所示，除標準菌株29544 外，其余菌株在pH1.0 和pH13.0 的強酸強堿處理下會立即死亡，證明強酸強堿能有效殺死阪崎腸桿菌。通過比較酸堿條件下實驗菌株的存活情況，阪崎腸桿菌對堿的整體耐受性要強于酸的耐受性。ES6 對酸的耐受性最強，當pH 為1.5 時，作用90s 時仍有活菌存在，而其他菌株在作用90s 后基本可以全部被滅活，由此可知不同菌株對酸堿度的耐受性也存在一定的差異。此外，當pH 為2.0、12.0 和12.5 時所有菌株均可存活，但存活數(shù)量會隨作用時間的延長而減少，且各菌株間的存活數(shù)量存在一定的差異。

2.3 阪崎腸桿菌的耐藥性

如表4 所示，藥敏實驗結果表明9 株阪崎腸桿菌對抗生素的敏感性基本一致，對青霉素、苯唑西林和萬古霉素3 種抗生素均有耐藥性，對阿莫西林/克拉維酸、氨芐西林、頭孢呋辛、頭孢他啶、頭孢吡肟、美洛培南、氨曲南、阿米卡星、慶大霉素、鏈霉素、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、甲氧芐啶/磺胺甲噁唑、氯霉素14 種抗生素均敏感。另外，僅ES6 對頭孢噻吩的敏感性處于中介值，其余菌株均為耐藥，僅ES4 對萘啶酸的敏感性處于中介值，其余菌株均為敏感。根據(jù)實驗結果分析可知，阪崎腸桿菌重慶市食品分離株的多重耐藥性主要可分為2 種類型:Ⅰ型耐藥譜為PEN+OXA +KF+VA，占88.89%，Ⅱ型耐藥譜為PEN +OXA +VA，占11.11%。

表2 溫度耐受實驗結果Table 2 Results of anti-thermal test

表3 酸堿耐受性實驗結果Table 3 Results of anti-acid and anti-alkaline test

表4 阪崎腸桿菌抗生素敏感性分布(n=9)Table 4 Antibiotic susceptibility of Enterobacter sakazakii(n=9)

3 結論

3.1 阪崎腸桿菌是近年來在食品生產(chǎn)、保存、運輸和銷售中較為活躍的一種病源微生物，人們對其關注度的提高與其對幼兒感染事件的頻發(fā)性有著密切的聯(lián)系，食用阪崎腸桿菌污染的嬰幼兒食品會致使免疫力低下及出生體重較低新生兒罹患敗血癥、腦膜炎和壞死性小腸結腸炎［5］。歐美國家已報道了多起嬰幼兒阪崎腸桿菌的感染病例，我國相關病例的報道較少，主要還集中于對市售奶制品阪崎腸桿菌的檢出率報道，其中2004 年安徽阜陽發(fā)生的劣質(zhì)奶粉事件中，阪崎腸桿菌的檢出率已達12.6%［6］。目前，對阪崎腸桿菌進行耐受性的研究報道較少，有必要研究了解阪崎腸桿菌對溫度、酸堿和抗生素的耐受性，以此指導食品生產(chǎn)和加工的衛(wèi)生和安全控制。

3.2 研究表明阪崎腸桿菌能形成一種菌毛結構的保護層，促使菌體間形成共生集合體，從而對高溫、清潔劑、殺菌劑和抗生素等產(chǎn)生很強的抵抗力［7］。Farber 等發(fā)現(xiàn)經(jīng)72℃處理的配方奶粉中仍有存活的阪崎腸桿菌［8］，胃酸環(huán)境(pH0.9～2.0)中亦有部分阪崎腸桿菌沒有滅活。對溫度、酸性環(huán)境的極強耐受性使得某些阪崎腸桿菌在奶粉加工、包裝、儲運、沖調(diào)和人胃等環(huán)境中均可存活并造成污染，引發(fā)疾病。本研究中，某些阪崎腸桿菌分離株對溫度和酸堿性具有較高的耐受性，從整體水平上看，采用60℃處理5min 或65℃處理短時可被滅活。在pH 為1.0 和13.0 的強酸強堿條件均有較好的殺菌效果，pH1.5 條件下作用90s 以上亦可使阪崎腸桿菌全部滅活。比較而言，阪崎腸桿菌對堿的耐受性要強于酸。另外，對溫度和酸堿度的最強或最弱耐受性并未集中表現(xiàn)在同一菌株上，這表明阪崎腸桿菌對溫度和酸堿度的耐受性并沒有明顯的關聯(lián)。本研究中的9 株阪崎腸桿菌對19 種抗生素的敏感性較為一致，與其他研究結果相比，耐藥性較低［9-10］，這可能與本研究中所實驗抗生素種類較少、菌株數(shù)量較少、菌株來源較為單一等因素有關。所有菌株均對阿莫西林/克拉維酸、氨芐西林、頭孢呋辛、頭孢他啶、頭孢吡肟、美洛培南、氨曲南、阿米卡星、慶大霉素、鏈霉素、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、甲氧芐啶/磺胺甲噁唑、氯霉素14 種抗生素均敏感。由于某些抗生素對嬰幼兒的骨關節(jié)軟組織和骨骼生長具有損傷作用，因此臨床使用時應結合藥物毒性和藥物敏感性等多方面因素進行綜合考量［11］。結合本研究的實驗結果分析，采用巴氏消毒法，即牛奶經(jīng)62 ～65℃處理30min 或72 ～75℃處理15s，基本可以殺死大部分的阪崎腸桿菌，但并不能排除某些耐受性極強菌株存活的可能性。因此，采用超高溫瞬時殺菌法，即將牛奶加熱至135℃保持2～4s的方式更為安全可靠。對于家庭操作而言，則應盡量采用70℃以上較高溫度的水來沖調(diào)奶粉。另外，對于生產(chǎn)加工和沖調(diào)環(huán)境的清潔，建議采用強酸性的殺菌劑或清潔劑，這樣可以有效降低奶粉和環(huán)境中微生物的存活率，從而防止阪崎腸桿菌污染的發(fā)生。

3.3 阪崎腸桿菌在環(huán)境和食品中的分布范圍十分廣泛，不僅能污染牛奶、蔬菜、生肉等食品，而且在奶粉的生產(chǎn)、包裝及奶粉的沖調(diào)環(huán)境中均可檢出。近年來有關奶粉的食品安全事件頻頻發(fā)生，提醒人們必須重視對奶粉等嬰幼兒食品的質(zhì)量控制。作為奶粉中易污染、危害大的阪崎腸桿菌而言，分析研究其耐受性能指導和改進食品生產(chǎn)企業(yè)的衛(wèi)生條件，協(xié)助HACCP 等操作規(guī)范的順利實施，有效降低阪崎腸桿菌的污染水平。除此之外，對消費者也有教育和指導意義，明確阪崎腸桿菌的耐受性，可以提示消費者在奶粉沖配時采用適當?shù)臏囟?、對沖調(diào)環(huán)境進行清潔，對感染病例還具有用藥指導作用。因此研究阪崎腸桿菌的耐受性對食品生產(chǎn)和食品質(zhì)量控制是十分重要的。另外，隨著分子生物學技術的不斷發(fā)展，有必要建立健全以PFGE 等分子分型技術為核心的食源性致病菌溯源分析體系，美國等國家已經(jīng)建立了有關的溯源數(shù)據(jù)庫，我國的相關工作也在展開。但對于食源性致病菌溯源體系的建立多局限于生理生化反應和分子分型等方面的信息，缺少對菌種耐受性等表型特征的記錄。所以，研究阪崎腸桿菌耐受性特征不僅能彌補菌種信息的不足，還能更好地指導食品生產(chǎn)，防治污染、控制傳播，保證食品安全。

［1］Nazarowec-White M，F(xiàn)arber J M.Enterobacter sakazakii: a review［J］.International Journal of Food Microbiology，1997，34(2) :103-113.

［2］Iversen C，F(xiàn)orsythe S.Risk profile of Enterobacter sakazakii，an emergent pathogen associated with infant milk formula［J］.Trends in Food Science ＆Technology，2003，14:443-454.

［3］鄭晶，魏丹琦，黃曉蓉，等.液態(tài)奶粉中分離的阪崎腸桿菌生物學性狀研究［J］.食品科技，2007，(12) :50-53.

［4］袁飛，徐寶梁，陳穎，等.阪崎腸桿菌生長特性及耐熱耐酸堿性分析［J］.中國公共衛(wèi)生，2008，24(12) :1475-1476.

［5］Fiore A，Casale M，Aureli P.Enterobacter sakazakii:epidemiology，clinical presentation，prevention and control［J］.Ann Ist Super Sanita，2008，44(3) :275-280.

［6］劉秀梅，裴曉燕，郭云昌.中國安徽阜陽劣質(zhì)嬰兒配方奶粉中阪崎腸桿菌的污染［J］.中國食品衛(wèi)生雜志，2005，17(1) :10-12.

［7］Lehner A，Stephan R.Microbiological，epidemiological，and food safety aspects of Enterobacter sakazakii［J］.Journal of Food Protection，2004，67(12) :2850-2857.

［8］Nazarowec- White M，F(xiàn)arber J M.Thermal resistance of Enterobacter sakazakii in reconstituted dried-infant formula［J］.Letters in Applied Microbiology，1997，24:9-13.

［9］徐英春，張小江，陳民鈞，等.腸桿菌屬的耐藥調(diào)查及抗感染用藥探討［J］.中華醫(yī)院感染學雜志，2001，11(1) :230-232.

［10］裴曉燕，郭云昌，徐進，等.嬰幼兒配方粉中阪崎腸桿菌分離株的藥敏分析［J］.衛(wèi)生研究，2007，36(1) :63-65.

［11］Dennison S K，Morris J.Multiresistant Enterobacter sakazakii wound infection in an adult［J］.Infect Med，2002，19( 11) :533-535.