霍 莉，陳 萍，彭 松，胡曉潔，王 頡，*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北保定071001;2.保定學(xué)院生化系，河北保定071000)

植物蛋白質(zhì)由于不含膽固醇，容易消化，具有動(dòng)物蛋白無(wú)法比擬的組成優(yōu)勢(shì)，而且氨基酸含量豐富，品質(zhì)好，對(duì)提高人體免疫力、保肝具有良好的作用，倍受國(guó)內(nèi)外研究者關(guān)注［1－4］?？嗖耸且环N藥食同源的多年生菊科苦荬菜屬草本植物，耐寒、耐熱、耐旱、耐瘠薄性均較強(qiáng)，各地均可大面積種植，全草都含有人體需要的多種營(yíng)養(yǎng)成分，有清熱涼血、解毒、消腫排膿之功效［5－10］，但苦菜不同部位性能不同，韓陽(yáng)陽(yáng)等［11］研究了苦菜不同部位提取物的抗氧化活性，王天曉等［12］測(cè)定了苦菜的不同部位金屬元素含量，而苦菜蛋白質(zhì)有待開發(fā)，有望應(yīng)用于醫(yī)藥、保健、化妝品等行業(yè)，不同部位蛋白質(zhì)和氨基酸還未見考察。植物蛋白質(zhì)和氨基酸測(cè)定方法有很多［13－16］，本文主要采用凱氏定氮法和高效液相色譜(HPLC)柱前衍生法對(duì)苦菜不同部位蛋白質(zhì)和17種氨基酸含量進(jìn)行測(cè)定，且采用了價(jià)廉的2，4－二硝基氯苯(CDNB)做衍生劑，重現(xiàn)性好，條件簡(jiǎn)便，毒性?。?7］，豐富了植物氨基酸含量測(cè)定的方法。擬為苦菜的充分利用，進(jìn)一步開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

苦菜(山苦荬)河北保定田間，鮮苦菜→洗凈→自然晾干→高速粉碎成粉末狀;鮮苦菜含水量為84.24%(稱重法);18種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品(見表2，還有色氨酸)北京拜爾迪生物技術(shù)公司和美國(guó)Sanland公司(純度≥99%);2，4－二硝基氯苯 上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司進(jìn)口部;乙腈為色譜純;硫酸、氫氧化鈉、硫酸銅、硫酸鉀、無(wú)水硫酸鈉、碳酸氫鈉、碳酸鈉、乙酸鈉均為分析純;鹽酸為優(yōu)級(jí)純;混合指示劑:V(溶解于95%乙醇的0.1%溴甲酚綠溶液)∶V(溶于95%乙醇的0.l%甲基紅溶液)=5∶1。

消解爐、凱氏定氮儀(KDY－9810)北京通潤(rùn)源機(jī)電有限公司;Agilent 1200高效液相色譜儀(四元梯度泵，DAD檢測(cè)器)美國(guó)Agilent公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蛋白質(zhì)的測(cè)定 按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.5－2010食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定［18］:凱氏定氮法測(cè)定苦菜蛋白質(zhì)含量。取0.5g樣品粉末放入定氮瓶中，加入W(CuSO4)∶W(K2SO4)=1∶3 混合物 6g，再加入 10mL濃H2SO4，消煮至溶液呈透明的藍(lán)綠色，冷卻，加入10mL蒸餾水稀釋。打開凱氏定氮儀，將消煮管固定于加堿處，加稍過量的400g/L的 NaOH溶液(約40mL)。將加有20mL 2%硼酸溶液和1～2滴混合指示劑的錐形瓶放在蒸餾托盤上，按蒸餾鍵進(jìn)行蒸餾，當(dāng)冷凝管口的冷凝液呈中性時(shí)(pH紙測(cè)定)即為蒸餾終點(diǎn);取下錐形瓶，再滴加1滴混合指示劑，用已標(biāo)定的HCl溶液進(jìn)行滴定，溶液由淺綠色變?yōu)闇\紅色時(shí)即為滴定終點(diǎn)。根據(jù)公式計(jì)算蛋白含量:

表1 苦菜蛋白質(zhì)含量Table 1 Content of Ixeris Chinensis(Thunb.)Nakai Protein on the different parts

式中:CHCl:HCl濃度(mol/L);V:樣品耗HCl體積(mL);V0:空白耗HCl體積(mL);m:苦菜質(zhì)量(g)

1.2.2 HPLC柱前衍生法分析氨基酸含量［17］

1.2.2.1 樣品處理 精確稱取的0.3g樣品粉末于小瓶中，加入10.00mL 6mol/L鹽酸，水解(110℃)14h，冷卻到室溫定容至10mL，取水解液1.00mL真空抽干，再加入2.00mL 0.1mol/L鹽酸溶解，備用。

1.2.2.2 樣品衍生 取100μL樣品水解液于1.5mL離心管中，加入緩沖溶液(pH9.0)200μL、300mg/mL 2，4－二硝基氯苯100μL，混勻，于90℃恒溫水浴鍋中避光反應(yīng)90min，反應(yīng)結(jié)束后加入10%(v/v)乙酸50μL，調(diào)pH為中性，以水定容至1.00mL，混勻，取上清液過0.45μm有機(jī)膜后，待測(cè)。

1.2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)樣品處理 分別稱取適量的18種氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)品，用0.1mol/L HCl定容于10mL容量瓶中，得到濃度均為500mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。將氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分別稀釋為 25、50、125、100、150、200、300、400、500mg/L 的溶液，各標(biāo)液取 100μL 按照樣品衍生方法衍生后進(jìn)行測(cè)定，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

1.2.2.4 色譜條件 美國(guó)Kromat Universil C18柱(4.6mm×250mm，5μm);流動(dòng)相A為乙腈;流動(dòng)B為乙酸－乙酸鈉緩沖液(0.03mol/L乙酸鈉溶液，加入0.15%三乙胺，再用冰乙酸調(diào)pH至5.25±0.50);梯度洗脫:0～10min，B 的體積分?jǐn)?shù)為82%;10～15min，B由82%～71%;15～25min，B 由 71%～66%;25～30min，B 由66%～45%;30～37min，B 由 45% ～40%;37～39min，B 由40%～82%;39～45min，B 為82%。進(jìn)樣量:10μL;柱溫40℃;檢測(cè)波長(zhǎng)360nm。組分用定性保留時(shí)間，定量用外標(biāo)法。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦菜蛋白質(zhì)含量

表1為凱氏定氮法測(cè)定春秋(5月和10月)兩季苦菜以及苦菜不同部位(10月)蛋白質(zhì)含量，可得到蛋白質(zhì)含量大小:春季苦菜多于秋季苦菜;葉＞花＞莖＞根;且葉蛋白高于花、莖、根。

2.2 苦菜氨基酸含量測(cè)定

2.2.1 苦菜氨基酸組分及含量分析 2，4－二硝基氯苯(CDNB)衍化法測(cè)定苦菜氨基酸組分色譜圖見圖1，除色氨酸被水解破壞外，可以分離出17種氨基酸。春秋(5和10月)兩季苦菜以及苦菜不同部位(10月)氨基酸組分及含量見表2:

圖12 ，4－二硝基氯苯(CDNB)衍化法測(cè)定苦菜氨基酸組分色譜圖Fig.1 Chromatogram of amino Acid Composition of Ixeris Chinensis(Thunb.)Nakai derivatized with CDNB

據(jù)表2可見，苦菜含有人體必需的(8種氨基酸)，半必需的豐富的氨基酸［19］，可以證明苦菜的藥用價(jià)值。其中天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸、脯氨酸含量較高，天冬氨酸、谷氨酸主要用于治療肝病、神經(jīng)衰弱、消化道疾病、腦病、心血管病、呼吸道等疾?。?0］。亮氨酸用于平衡異亮氨酸，參與胸腺、脾臟及甲狀腺、性腺的調(diào)節(jié)以及代謝;脯氨酸可協(xié)助膠原蛋白形成，刺激垂體分泌生長(zhǎng)激素，可幫助牙釉質(zhì)生長(zhǎng)和提高機(jī)體免疫功能和降高血壓作用［19，21］。且春季苦菜全草氨基酸總量略高于秋季，苦菜不同部位的氨基酸總量和各氨基酸含量(除酪氨酸(Tyr)外)大都為:葉＞花＞莖＞根，且葉中氨基酸顯著高于花、莖、根;與上述蛋白質(zhì)測(cè)定結(jié)果相同。其中還測(cè)定出苦菜葉和花中含有一定量的?；撬幔仪o和和根中沒有檢測(cè)到。?；撬嵩谥参镏泻苌俸?，海鮮和貝類中含量最為豐富［22］，?；撬峋哂锌寡趸?、抗衰老作用，可促進(jìn)脂質(zhì)代謝，提高免疫能力等功效。說明苦菜的營(yíng)養(yǎng)和保健功能可進(jìn)一步研究和開發(fā)。

2.2.2 方法的穩(wěn)定性、精密度與回收實(shí)驗(yàn) 文獻(xiàn)［17］考察方法的線性關(guān)系良好，此法用于苦菜氨基酸測(cè)定，將其衍生的對(duì)照品在室溫放置0、1、2、3、4 d后進(jìn)行測(cè)定，并以色譜峰峰面積為指標(biāo)計(jì)算RSD，考察衍生物的穩(wěn)定性，17種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)RSD在1.80%～5.40%(n=5)，方法穩(wěn)定性亦良好。

表2 苦菜氨基酸組分及含量Table 2 Contents of amino Acid Composition on Ixeris Chinensis(Thunb.)Nakai

取對(duì)照品溶液100μL連續(xù)進(jìn)樣5次以色譜峰峰面積為指標(biāo)計(jì)算RSD，考察方法的精密度，17種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的精密度實(shí)驗(yàn)RSD在1.0%～5.6%(n=5)。

以天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸為對(duì)象進(jìn)行回收率測(cè)定。平行稱5份適量苦菜葉樣品，經(jīng)水解后衍生后，將混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)(200 mg/L)添加到同一種樣品中，進(jìn)行回收率測(cè)定。三種氨基酸的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD和樣品加標(biāo)回收率見表3。結(jié)果表明，RSD在1.65%～1.89% 之間，樣品加標(biāo)回收率范圍在103.2%～108.6%。說明該方法精密度和準(zhǔn)確度較高。

表3 苦菜葉樣品氨基酸回收率測(cè)定Table 3 Recovery of amino acid in leaf of Ixeris Chinensis(Thunb.)Nakai

3 結(jié)論

苦菜富有蛋白質(zhì)和多種氨基酸。春季苦菜蛋白質(zhì)和氨基酸含量多于秋季苦菜，苦菜不同部位的蛋白質(zhì)和氨基酸總量以及各氨基酸含量明顯不同，大都為葉＞花＞莖＞根，且苦菜葉和花中含有一定量的?；撬?。為進(jìn)一步研究、充分利用和開發(fā)苦菜不同部位功用提供理論依據(jù)。

采用改進(jìn)的2，4－二硝基氯苯(CDNB)為衍生劑高效液相色譜柱前衍生法分析了苦菜氨基酸含量，氨基酸含量分析方法有很多:鄰苯二醛(OPA)、異硫氰酸苯酯(PITC)法、6－氨基喹啉－N－羥基琥珀酰亞氨基氨基甲酸酯(AQC)法和9－芴甲基氯甲酸甲酯(FMOC)法、2，4－二硝基氟苯(DNFB)法，但都存在一定的缺點(diǎn)［14］。而試劑CDNB價(jià)廉易得、制備試樣較簡(jiǎn)單、穩(wěn)定、無(wú)干擾且分離效果好，適于含各種氨基酸試樣的分析，豐富了植物氨基酸含量測(cè)定方法。

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