范金波，周素珍，鄭立紅，任發(fā)政，呂長鑫，馮敘橋，*

(1.渤海大學食品科學研究院，遼寧省食品安全重點實驗室，遼寧錦州121013;2.河北科技師范學院，食品工程系，河北昌黎066000;3.中國農業(yè)大學，食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京100083)

果蔬是膳食的重要組成部分，無論是鮮食還是加工品在日常生活中都占有重要的地位。隨著人們生活水平的提高，人們對于食品的要求越來越高，更傾向于食用富含功能活性成分的食品。研究表明，果蔬作為植物源性食品原料，富含功能活性成分，包括膳食纖維、酚類、烯丙基硫化物、類胡蘿卜素、植物固醇等［1］。植物多酚是植物體內的一種次生代謝產物，具有抗氧化、抗癌、抗輻射、降血壓、預防心腦血管疾病等多種功能活性［2－5］。果蔬在加工、儲藏、食用等過程中，其中的活性成分會與蛋白質發(fā)生作用，進而影響食品的色澤、風味和營養(yǎng)價值，并改變或影響多酚和蛋白質的功能特性。因此，國內外學者近年來就多酚與蛋白質相互作用進行了大量研究。常用的研究方法包括紫外－可見吸收光譜法、熒光光譜法、圓二色譜法、傅里葉變換紅外光譜法、平衡透析法、液相色譜法等，隨著實驗技術進步，質譜、核磁共振、毛細管電泳、激光拉曼散射等方法的應用日益增多。另外，計算機分子模擬技術可以在分子水平上研究小分子與蛋白質相互作用的信息。利用這些方法可以獲得關于多酚－蛋白質復合物作用的結合常數、結合位點數、結合位置、作用力類型等信息。研究表明多酚－蛋白質復合物主要是靠氫鍵和疏水相互作用維系，多酚－蛋白質相互作用在不同的體系中受諸多因素的影響［6］。本文綜述了果蔬中的酚類成分，并對其與蛋白質的相互作用進行了探討，以期為了解活性成分對食品質量的影響和促進活性成分的應用提供參考。

表1 常見果蔬中的酚類成分Table 1 Common phenolic compounds in fruits and vegetables

1 果蔬中的酚類成分

酚類化合物指芳香烴中苯環(huán)上的氫原子被羥基取代所生成的化合物，是植物的重要次生代謝產物。酚類化合物對于植物的生長發(fā)育、抗病害、抗脅迫等起著重要的調節(jié)作用［7］，對植物源食品的色澤、風味及抗氧化活性等都有非常重要的影響［8］。酚類根據其分子所含的羥基數目可分為一元酚和多元酚或多酚(即單寧)。酚類具有優(yōu)良的抗氧化性，其酚羥基極易被氧化，對自由基有很強的捕捉能力［9］。多酚具有抗氧化、抗癌、抗輻射、降血壓、預防心腦血管疾病、抑制神經變性等生物學活性［2－5］。酚類成分主要包括單寧、類黃酮、酚酸、木質素等。常見果蔬中的酚類成分見表 1［10－13］。

1.1 單寧

單寧即多酚，是分子中具有多個羥基的酚類成分，廣泛存在于蔬菜和水果的皮、根、葉、果中，現在發(fā)現大約有8000多種［14］。最近對于食用多酚的研究主要集中在它們的保健及抗氧化特性上。人攝入富含多酚食品的多少與人患癌癥、心血管疾病的機率關系緊密，多酚的攝入具有一定的預防和保護作用［15］。多酚具有防御病毒、保護植物的作用，在植物的生長中扮演重要角色，賦予植物顏色和某些特性［16］。人工合成抗氧化劑如 BHA(Butyl Hydroxy Anisd，丁 基 羥 基 茴 香 醚)、BHT(Butylated Hydroxytoluene，二丁基羥基甲苯)等由于其潛在的危害已經被限制使用，多酚作為天然抗氧化劑替代合成抗氧化劑已經成為發(fā)展趨勢。目前果蔬多酚物質研究的熱點主要有蘋果多酚和葡萄多酚［17－18］。近年來，研究發(fā)現蘋果多酚有極強的抗氧化活性，10mg/mL時對羥基自由基的清除率高達90%，同時在1～10mg/mL范圍內清除率與多酚濃度呈正相關［19］。Petti 和 Scully［20］研究發(fā)現:蘋果多酚具有抑制牙周致病菌活性，從而有效抑制牙齦疾病的發(fā)生和預防口腔癌。還有其它研究表明:蘋果多酚具有抗輻射性和降低膽固醇的作用［21－22］。

1.2 類黃酮

類黃酮是一大類以苯色酮環(huán)為基礎的酚類化合物，分為黃酮、黃酮醇、黃烷醇、黃烷酮、黃烷酮醇、花色素苷、異黃酮等，廣泛存在于蘋果、香蕉、草莓、南瓜、胡蘿卜、西紅柿等水果、蔬菜中。最初黃酮類化合物生物活性的研究主要集中在對自由基的清除上［23］，最近研究表明，類黃酮還具有抗癌、改善心血管疾病、抗過敏、抗炎、抗菌和酶的抵制、雌激素作用等活性［24］。Day 和 Williamson［25］在 1999 年研究了類黃酮物質的攝入量與人體慢性病之間的關系，對805名65歲到84歲間的荷蘭老年男子進行過為期5年的實驗觀察，在這5年時間里主要通過控制攝入茶葉、洋蔥、蘋果等使類黃酮的攝入量平均每人每天為26mg，結果發(fā)現冠心病的死亡率與類黃酮物質的攝入量呈現明顯的負相關。人們對以槲皮素為代表的黃酮醇類物質的生理活性尤其是抗氧化作用，即對氧自由基以及脂質過氧化物的清除能力的研究，也日益增加［26］，這些生物學性質又可能與癌癥、動脈硬化及其它一些炎癥的病理條件有關［27］。

2 果蔬多酚與蛋白質的相互作用

在食品工業(yè)中，酚類與蛋白質的相互作用會直接影響到食品本身的品質。如長期放置的啤酒、果汁、復合飲料會產生混濁現象，當加入蛋白酶時渾濁消失，主要是由于放置過程中蛋白質與多酚聚合沉積［28］。近年來，多酚在食品、藥品、化妝品領域有越來越廣泛和深入的應用，這一切都源于人們對于多酚與蛋白質相互作用規(guī)律的認識。因此，只有更科學地認識多酚與蛋白質的相互作用機制，才能更加廣泛和科學地應用多酚。

2.1 多酚與蛋白質相互作用的原理

近年來，國內外學者對多酚蛋白質相互作用機制進行了大量的研究。最初研究認為它們的復合是氫鍵所致，隨著研究的深入，現已經確認多酚與蛋白質的結合主要由氨基酸側鏈與多酚芳環(huán)間的氫鍵、疏水作用等弱相互作用所致。研究認為引起啤酒混濁的蛋白質主要為大麥醇溶蛋白，混濁量與蛋白質中脯氨酸含量呈線性關系，而對于不含脯氨酸的蛋白質則不產生混濁現象［29］。進一步的研究表明，多酚對于蛋白質的結合具有選擇性，不同的多酚對于不同的蛋白質結合能力差異很大［30］。茶多酚類化合物對β－乳球蛋白有較強的親和能力，多酚與蛋白的結合減少了無規(guī)卷曲結構的比例，同時使α－螺旋結構和β－折疊的比例增加，從而提高了β－乳球蛋白的穩(wěn)定性，穩(wěn)定性隨著多酚分子大小、濃度的增大而增強［29］，而且相對分子質量較大，結構開放較松散，脯氨酸或其它疏水性氨基酸含量較高的蛋白質對多酚表現出高親和性［30－31］。多酚－蛋白質結合是分子識別的典型例子，不僅要考慮蛋白質的分子組成、結構和構型，同時也要考慮多酚的結構和構型。Haslam等［32］認為，可用“手－手套”模型來說明此反應，蛋白質分子中疏水基團較集中的部位構成“疏水袋”就形成“手套”部分，而多酚分子進入其中并通過氫鍵結合形成“手”部分。Hasni等［33］通過結構模型發(fā)現茶多酚與乳蛋白結合時幾種氨基酸殘基對于氫鍵網絡的形成起到重要的作用。

2.2 相互作用對多酚功能活性的影響

多酚與蛋白質相互作用的同時會影響多酚物質的活性。Rawel等［34］研究表明藍莓汁和牛奶同時被人體攝入時會降低藍莓的抗氧化活性;β－乳球蛋白與茶多酚形成復合物時，隨著多酚分子體積的增大，結合能力增強，導致供電子能力減弱，從而降低了茶多酚的抗氧化活性［35］。Arts 等［36］研究表明黃酮類物質與血漿白蛋白作用后，黃酮的抗氧化活性降低。余丹丹等［37］研究表明咖啡酸與乳蛋白結合導致咖啡酸的抗氧化能力受到不同程度的抑制。Mariana等［38］研究表明乳清蛋白的存在對不同的阿根廷綠茶抗氧化活性和抗菌活性具有一定的掩蓋作用，且隨著乳清蛋白濃度的增加而增強。大量的研究都證實了多酚與蛋白質相互作用會使多酚類物質抗氧化和抗菌等活性受到一定程度的抑制，因此在單獨考慮多酚類物質功能活性時，應盡量避免與蛋白質類食品同時攝入，以減少活性的損失。

2.3 相互作用對蛋白質功能特性的影響

許多研究都已經證實，多酚與蛋白質相互作用的同時也會影響蛋白質的功能特性。單寧與蛋白質可以形成復合物而降低食品的營養(yǎng)價值，同時可與消化酶形成絡合沉淀從而抑制消化酶活性，影響機體對營養(yǎng)成分的吸收［39－40］。

蛋白質功能特性包括水合作用、界面性質和結構性質，具體包括蛋白質的溶解性、吸水性、黏彈性、乳化性、起泡性、凝膠作用等［41］。不同蛋白質－多酚相互作用對蛋白質功能特性的影響也各不相同，綠茶多酚可有效地增強β－乳球蛋白的發(fā)泡能力和改善其泡沫穩(wěn)定性，其主要原因是蛋白質－多酚的相互作用增強了界面蛋白質之間形成的疏水鍵和氫鍵［42］。茶多酚可以顯著改善蛋白質起泡特性和凝膠性，Seshadri等［43］指出茶多酚能夠顯著改善蛋清蛋白的發(fā)泡特性;吳衛(wèi)國等［44］實驗證明1.0%的雞蛋蛋清溶液中加入0.25%的茶多酚時，雞蛋蛋白的發(fā)泡能力和發(fā)泡穩(wěn)定性增加4～5倍，而且發(fā)現茶多酚的加入改變了凝膠強度和凝膠溫度。另外研究證實，茶多酚能顯著地提高大豆分離蛋白的起泡性和泡沫穩(wěn)定性，但對其乳化特性無顯著性影響［45］。蛋白質的改性是食品工業(yè)發(fā)展的需要，酶法和非酶法改變都存在一定程度的缺陷或危害，目前科學家仍在尋找新的改性方法，多酚的出現及其在食品中越來越多的應用，給蛋白質改性提供了新的途徑［14］。

3 多酚與蛋白質相互作用的研究方法

小分子與蛋白質相互作用的研究是化學生物學的重要內容，該研究能為生命科學、化學、食品營養(yǎng)學等提供豐富的信息資源。常用的方法主要有光譜法、電化學方法、色譜法，其中光譜法應用最廣泛，包括紫外－可見吸收光譜法、熒光光譜法和傅里葉變換紅外光譜法。通過這些方法可以獲得蛋白質與小分子配體作用的結合常數、結合位點數、結合位置、作用力類型以及蛋白質結構與功能變化等信息。本文重點介紹紫外－可見吸收光譜法、熒光光譜法和傅里葉變換紅外光譜法在多酚與蛋白質相互作用方面的應用和研究進展。

3.1 紫外－可見吸收光譜法

蛋白質中芳香族氨基酸色氨酸(吲哚基)、酪氨酸(酚基)、苯丙氨酸(苯基)因含有特定的基團，在紫外區(qū)有吸收。一般在蛋白質的紫外吸收光譜中，280nm處是酪氨酸、色氨酸的吸收峰，257nm是苯丙氨酸的吸收峰，210nm是肽鍵的吸收峰［46］。當向蛋白質中加入小分子物質后，往往導致蛋白質生色基團紫外吸收光譜的變化，據此可以了解氨基酸微環(huán)境的變化，結合后紫外吸收光譜發(fā)生變化就說明蛋白質的構象發(fā)生了變化［47］。文鵬程等［48］利用紫外光譜法研究了不同小分子物質對于蛋白質構象的影響，結果表明二硫蘇醇對乳鐵蛋白二硫鍵破壞最嚴重，超過總二硫鍵含量的55%，鹽酸胍和巰基乙醇對二硫鍵破壞較少。借助于紫外吸收光譜可輔助判斷小分子對蛋白質的熒光猝滅機理［49］，計算小分子與蛋白質的結合常數。Hasni等［43］利用光譜計算了酪蛋白與不同茶多酚結合的結合常數，與熒光法計算結果比較沒有明顯的差異。

余丹丹等［37］通過紫外吸收光譜和熒光光譜研究了咖啡酸與乳蛋白結合的光譜學特性，結果表明咖啡酸會使乳蛋白發(fā)生內源性熒光猝滅，咖啡酸與α－酪蛋白之間以靜電引力結合，與β－酪蛋白、α－乳白蛋白的結合作用力為氫鍵，與κ－酪蛋白β－乳球蛋白是以疏水作用力結合。兩者結合距離符合非輻射能量轉移條件，證明咖啡酸對乳蛋白的熒光猝滅是由于生成不發(fā)光的配合物而引起的靜態(tài)猝滅。劉媛等［50］通過紫外光譜分析研究了貝加因黃酮與不同異構體人血清白蛋白相互作用的機制，結果表明在弱堿性條件下，貝加因的紫外吸收光譜發(fā)生了明顯的變化，說明其A環(huán)上的羥基發(fā)生了解離，而在pH4.5～2.0范圍內，貝加因的結構基本保持不變;貝加因與不同異構體的人血清白蛋白作用后，其紫外光譜吸收I帶發(fā)生顯著的紅移，顯示出藥物與蛋白質發(fā)生了特異性的結合。

3.2 熒光光譜法

熒光光譜法是研究生物大分子與小分子相互作用應用最廣泛的一種方法［51］，該方法可以提供較多的熒光參數如激發(fā)光譜、發(fā)射光譜、熒光強度、量子產率、熒光壽命、熒光偏振等。這些參數能夠反映分子的結構和發(fā)光特性，根據這些參數可以對蛋白質進行定量分析和結構預測［52］。研究者常利用蛋白質自身的內源熒光作為探針，內源熒光主要來源于酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸殘基，由于苯丙氨酸量子產率低、酪氨酸電離后熒光幾乎全部猝滅，因此色氨酸最常被用作內源探針來研究蛋白質的構象及其與小分子的相互作用［52］。

熒光光譜法包括熒光猝滅法、熒光增強法、同步熒光、熒光偏振等，其中蛋白質與小分子相互作用常采用熒光猝滅法。所謂熒光猝滅是指熒光物質分子與溶劑分子或其他溶質分子相互作用引起熒光強度降低的現象。熒光猝滅可分為靜態(tài)猝滅和動態(tài)猝滅，兩種猝滅都遵循 Stern－Volmer方程［53］。通過熒光光譜可以獲得蛋白質與小分子配體作用的結合常數、結合位點數、結合位置、作用力類型等信息。

劉媛等［50］利用熒光光譜證實貝加因對不同異構體的熒光猝滅機制主要為靜態(tài)猝滅過程，通過藥物對蛋白質的熒光猝滅實驗，計算出了它們之間的結合常數。研究結果表明，藥物與蛋白質的結合常數隨pH的降低而減小;與不同異構體蛋白質作用后，藥物的熒光發(fā)射峰有顯著的增強效應。實驗結果充分證明貝加因與不同異構體的蛋白質之間形成了復合物，藥物分子結合在蛋白質IIA亞域鄰近色氨酸殘基的SiteI結合位點。

3.3 傅里葉變換紅外光譜法

近紅外光譜可提供的信息十分豐富，包括物質的組成、構象、結晶、分子內和分子間相互作用，十分適合于聚合物的研究分析［54］。近年來近紅外光譜技術逐漸發(fā)展成為最引人注目的分析手段之一。在蛋白質結構分析中，紅外光譜有其突出的優(yōu)點，它適用于不同狀態(tài)、不同濃度及不同環(huán)境中蛋白質和多肽的測定。目前已經成為研究蛋白質二級結構變化的有力手段之一［55］。

Holly 等［56］和 wang 等［57］利用紅外光譜技術來測試多肽鏈并建立了初步的峰位歸屬。Izutsu等［58］將近紅外技術應用于蛋白質溶液和凍干的樣品中，通過對比牛血清蛋白、溶解酵素、卵清蛋白、球蛋白等一系列蛋白質的近紅外特征譜，來探究蛋白質在溶液狀態(tài)中和凍干后的二級結構變化。結果證明近紅外確實能夠提供構象相關信息，α－螺旋和β－折疊分別對應特有的吸收峰，峰強會隨著構象變化而發(fā)生變化。除了不會對樣品造成任何破壞，近紅外光譜還具有動態(tài)跟蹤蛋白質結構變化過程的優(yōu)勢。

4 結語

人們對多酚－蛋白質相互作用進行了大量的研究，取得了一定的成果，但是對于多酚蛋白質相互作用的機制并不明了。多酚蛋白質除了受到自身結構、大小等因素的影響外，同時受其在食品體系、人體代謝過程中等環(huán)境因素影響，為了更好地研究多酚蛋白質相互作用的機理，還需要在分子水平上進行深入研究，如參與復合的蛋白質的空間結構、構象改變，相互作用對多酚生物活性和對蛋白質功能特性的影響等。這些深入研究將有助于多酚在食品、化工、醫(yī)藥等領域中的廣泛應用，對于提高天然抗氧化劑多酚的綜合利用具有重要意義。

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