薛珊珊，王曉洋，李 丁，牛 卿，馬振毅

（天津醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院1.免疫學系；2.生物化學與分子生物學系，天津300070）

近年來在實體腫瘤細胞轉(zhuǎn)移研究中發(fā)現(xiàn)，p8由于其潛在的多方面功能而逐漸引起了重視。p8/NUPR1（Nuclear protein 1）/com-1（candidate of metastasis-1）是一個只有82個氨基酸的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，沒有穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)。p8基因剪切后形成亞型a或亞型b。迄今為止，關(guān)于p8的生物化學和分子生物學研究都是集中于亞型b，所以通常p8指的是亞型b。長亞型a比短亞型b多了18個氨基酸，這個外加的18個氨基酸的功能尚不完全清楚。在多種應(yīng)激條件下p8可以被誘導表達，其生物學功能似乎和細胞所處的內(nèi)外環(huán)境相關(guān)，比如可以誘導腫瘤細胞生長和轉(zhuǎn)移[1-3]或抑制腫瘤的生長[4-5]，也有實驗證實p8和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫誘導的細胞自噬相關(guān)[6]。在不同的組織中，p8功能也不同，甚至功能相反。在胰腺癌和乳腺癌細胞中，p8與腫瘤細胞的凋亡呈負相關(guān)[7]，其具體功能不詳，而且p8可以作為一種潛在的藥物靶點抑制腫瘤細胞的生長和轉(zhuǎn)移。本實驗針對p8進行亞克隆，通過缺陷病毒體外產(chǎn)生分泌蛋白，用于體外結(jié)合蛋白分子的鑒定，為研究p8的生物學功能提供實驗工具。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑 CO2培養(yǎng)箱（Thermo），蛋白質(zhì)電泳儀器（Bio-Rad），倒置熒光顯微鏡（上海長方光學儀器廠），低溫高速離心機（Eppendorf）。細胞系與培養(yǎng)條件：慢病毒包裝細胞Fx細胞來自本實驗室，細胞在37℃、5%CO2、飽和濕度下用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。質(zhì)粒pDisplay（Invitrogen，V660-20），慢病毒包裝系統(tǒng)來自本實驗室。限制性內(nèi)切酶來自New England Biolabs Inc.，E.coli DH5α和質(zhì)粒提取試劑盒購于原平皓試劑有限公司。DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清和胰蛋白酶源于Hyclone，引物購自Invitrogen，鼠源抗Flag抗體購自Sigma-Aldrich，辣根過氧化物酶耦聯(lián)的羊抗鼠抗體購自 Jackson Lab，底物 Chemiluminescent HRP substrate購自Millipore，其它實驗試劑購自Sigma-Aldrich。

1.2 缺失HA和Myc表達序列的pDisplay質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 載體pDisplay含有Igκ信號肽Hemagglutinin A，HA-Myc-PDGFR跨膜結(jié)構(gòu)域組分，多克隆位點含 BglⅡ，SmaⅠ，PstI和 SalI，以此載體為模板，以pdis501SmaⅠ-SalⅠ和pdis301SmaⅠ-BglⅡ為引物（引物序列見表1）利用模板中的回文結(jié)構(gòu)使引物與模板進行不對等配對來進行擴增，去除HA-Myc標記，產(chǎn)物大小約為5.3 kb，PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶SmaⅠ和PstⅠ酶切后連接，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，以菌落PCR鑒定并篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒，以限制性內(nèi)切酶SmaⅠ和PstⅠ酶切鑒定并經(jīng)DNA序列測定進一步驗證，正確的克隆命名為pDisplay-SS。

1.3 pDisplay-SS-disF質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 寡核苷酸dis-F51和dis-F31的退火產(chǎn)物（含凝血因子Xa識別位點IEGR和Flag標記序列DYKDDDDK，Xa-Flag）構(gòu)建入缺失pDisplay-SS質(zhì)粒的SmaⅠ-SalⅠ酶切位點之間，構(gòu)建的質(zhì)粒命名為pDisplay-SS-disF，轉(zhuǎn)化與1.2相同，質(zhì)粒提取，通過測序進行驗證。

1.4 pDis-SS-disF-p8質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 以p8-503 BglⅡ和p8-303 SmaⅠ為引物（引物序列見表1），以小細胞肺癌細胞H69總RNA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板擴增p8cDNA序列，將p8cDNA構(gòu)建入pDis-SS-disF質(zhì)粒的SmaⅠ和BglⅡ酶切位點之間，構(gòu)建的質(zhì)粒命名為pDis-SS-disF-p8，轉(zhuǎn)化與1.2相同，質(zhì)粒提取，通過測序進行驗證。

1.5 305-p8質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 以Dis35和Dis55為引物（引物序列見表1），pDis-SS-disF-p8為模板進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物構(gòu)建入305質(zhì)粒（含有IRES-GFP片段）的兩個BamH I酶切位點之間，構(gòu)建的質(zhì)粒命名為305-p8，轉(zhuǎn)化與1.2相同，質(zhì)粒提取，通過測序進行驗證。

1.6 305-p8慢病毒的包裝和分泌型融合蛋白p8的產(chǎn)生 利用Millipore的磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑盒，將構(gòu)建好的305-p8與pMDL、Rev和VSVG 3個慢病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入Fx293細胞，具體操作按Millipore的磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進行。轉(zhuǎn)染24 h后更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)且以后每24 h用0.22 μm的濾膜過濾收1次病毒上清液，除去細胞碎片，并加入 8 μg/mL的 polybrene，于-80℃凍存，連收 3次。轉(zhuǎn)染48 h后利用熒光顯微鏡觀察細胞是否表達GFP，如果表達說明轉(zhuǎn)染成功，用Western blot檢測表達的效果。

表1 實驗用到的寡核苷酸序列Tab 1 The oligonucleotide sequences in the experiment

2 結(jié)果

2.1 缺失HA和Myc標記序列的pDisplay-SS質(zhì)粒的構(gòu)建 以dis501SmaⅠ-SalⅠ和dis301SmaⅠ-BglⅡ為引物擴增質(zhì)粒pDisplay，產(chǎn)物大小約為5.3 kb（圖1），經(jīng)SmaⅠ和PstⅠ酶切后連接、轉(zhuǎn)化，并提取質(zhì)粒，經(jīng)SmaⅠ和PstⅠ分別酶切及測序證實成功構(gòu)建了缺失HA和Myc標記序列的pDisplay-SS質(zhì)粒。

圖1 pDisplay-SS質(zhì)粒PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果Fig 1 Detection of pDisplay-SS PCR product by agarose gel electrophoresis

2.2 成功構(gòu)建pDis-SS-disF質(zhì)粒 將Xa-Flag序列構(gòu)建入缺失HA和Myc表達序列的pDisplay-SS質(zhì)粒，并經(jīng)測序證明Xa-Flag序列無突變，成功構(gòu)建pDis-SS-disF質(zhì)粒。

2.3 pDis-SS-disF-p8質(zhì)粒的構(gòu)建 由dis-F51和dis-F31的退火產(chǎn)物（含Xa-Flag）構(gòu)建入pDisplay-SS質(zhì)粒的SmaⅠ-SalⅠ酶切位點之間，得到pDis-SS-disF；以p8-503 BglⅡ和p8-303 SmaⅠ為引物，擴增得到p8cDNA序列，將其構(gòu)建入pDis-SS-disF質(zhì)粒得到pDis-SS-disF-p8，經(jīng)SalⅠ和BglⅡ酶切鑒定克隆成功（圖2）；以Dis35和Dis55為引物，pDis-SS-disF-p8為模板，擴增產(chǎn)物構(gòu)建入305質(zhì)粒的BamH I位點，測序證實p8序列無突變。

圖2 SalⅠ和BglⅡ雙酶切鑒定pDis-SS-disF-p8質(zhì)粒電泳圖Fig 2 Agarose electrophoresis detection of pDis-SS-disF-p8plasmid digested by BglⅡ and SalⅠ

2.4 產(chǎn)生Igκ信號肽-p8-Xa-Flag-PDGFR跨膜結(jié)構(gòu)域的融合蛋白 將上述構(gòu)建的Igκ信號肽-p8-Xa-Flag-PDGFR跨膜結(jié)構(gòu)域在305慢病毒載體中產(chǎn)生病毒，轉(zhuǎn)染到Fx細胞內(nèi)，24 h后熒光顯微鏡下觀察顯示轉(zhuǎn)染效率達80%以上，收集蛋白，并用Anti-Flag抗體檢測（圖3），細胞內(nèi)確實產(chǎn)生了融合蛋白。

圖3 Anti-Flag Western blot檢測融合蛋白的表達Fig 3 Anti-Flag Western blot detection of p8 fusion protein expression

3 討論

本實驗利用PCR誘變的方法去除pDisplay質(zhì)粒中的HA和Myc標記序列隨后順序?qū)a識別位點、Flag標記序列與p8表達序列構(gòu)建入pDisplay質(zhì)粒，最終通過將Igk信號肽-p8-Xa-Flag-PDGFR跨膜結(jié)構(gòu)域構(gòu)建入30′慢病毒載體，成功獲得了p8的超表達載體，以用于p8基因的真核表達。隨后通過慢病毒介導的外源基因載體感染Fx293細胞超表達p8融合蛋白，通過Western blot確證了外源融合蛋白的表達，這為在動物體內(nèi)表達外源分泌蛋白奠定了實驗基礎(chǔ)。此外，對于體外分離和鑒定與融合蛋白結(jié)合的蛋白分子，我們可以采用凝血因子Xa的酶切識別位點及鑒定的方法，將結(jié)合的蛋白分子通過蛋白質(zhì)質(zhì)譜來鑒定，建立p8表達的方法有助于p8的功能深入研究。

［1］Ree A H,Pacheco M M,Tvermyr M,et al.Expression of a novel factor,com1,in early tumor progression of breast cancer[J].Clin Cancer Rev,2000,6（5）:1778

［2］Ree A H,Tvermyr M,Engebraaten O,et al.Expression of a novel factor in human breast cancer cells with metastatic potential[J].Cancer Res,1999,59（18）:4675

［3］Chowdhury U R,Smaant R S,Fodstad O,et al.Emerging role of nuclear protein 1（NUPR1）in cancer biology[J].Cancer Metastasis Rev,2009,28（1/2）:225

［4］Jiang W G,Davies G,Martin T A,et al.Com-1/p8 acts as a putative tumor suppressor in prostate cancer[J].Int J Mol Med,2006,18（5）:981

［5］JiangWG,DaviesG,KynastonH,etal.Does the PGC-1/PPARgamma pathway play a role in Com-1/p8 mediated cell growth inhibition inprostatecancer[J].MolMed,2006,18（6）:1169

［6］Salazar M,Carracedo A,Salanueva I J,et al.Cannabinoid action induces autophagy-mediated cell death through stimulation of ER stress in human glioma cells[J].Clin Invest,2009,119（5）:1359

［7］Su S B,Motoo Y,Iovanna J L,et al.Overexpression of p8 is inversely correlated with apoptosis in pancreatic cancer[J].Clin Cancer Res,2001,7（5）:1320