任恒昌 ，杜洪印 ，喻文立，劉 璐 ，徐如彬 ，于建健 ，王玉亮

（1.天津醫(yī)科大學(xué)一中心臨床學(xué)院麻醉科，天津300192；2.天津市第一中心醫(yī)院麻醉科，天津300192；3.天津市第一中心醫(yī)院手術(shù)中心，天津300192；4.天津市胸科醫(yī)院麻醉科，天津300051；5.衛(wèi)生部危重病急救醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300384）

缺血再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）損傷引起的移植腎功能障礙是影響同種異體腎移植手術(shù)治療效果的重要因素。氧化應(yīng)激是I/R損傷產(chǎn)生的重要機(jī)制。大量細(xì)胞毒性氧自由基的產(chǎn)生可引起脂質(zhì)和DNA的氧化損傷，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致腎臟細(xì)胞的壞死和凋亡；而壞死細(xì)胞釋放的各種炎癥因子會(huì)進(jìn)一步加重炎癥反應(yīng)，形成惡性循環(huán)。因此，減輕細(xì)胞毒性氧自由基介導(dǎo)的氧化損傷可能成為改善術(shù)后移植腎功能的有效手段。研究表明，氫氣具有顯著的選擇性抗氧化作用，通過各種給藥途徑（吸入、靜脈或腹腔注射含氫生理鹽水等）進(jìn)入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)后，均能減輕腦、脊髓、心臟和肺臟等器官的I/R損傷[1-3]。近幾年，氫氣在移植器官保存中的保護(hù)作用受到了越來越多的重視。Buchholz等[4]的研究證明在小腸移植的大鼠模型中，含氫的UW液對(duì)移植的小腸具有抗氧化、抗炎癥的作用，而含氫的腎保存液對(duì)移植腎的I/R損傷是否具有保護(hù)作用卻尚未見報(bào)道。本研究采用Takada等[5]報(bào)道的大鼠腎臟冷I/R損傷模型，旨在觀察含飽和氫氣的HC-A腎保存液對(duì)大鼠腎臟冷I/R損傷的影響，為臨床研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 HC-A離體腎保存液（上海長征醫(yī)院）；0.7 mm×19.0 mm的動(dòng)脈留置針（美國BD公司）；丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性試劑盒（南京建成生物工程有限公司）；半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白-3（caspase-3）活性試劑盒（美國US Biological公司）；全自動(dòng)生化分析儀（瑞士Roche公司）；Microfuge 22R Centrifuge離心機(jī)（美國Beckman coulter公司）；RM2016病理切片機(jī)（美國Leica公司）。

1.2 含飽和氫氣HC-A離體腎保存液的制備 本研究參照Ohsawa等[6]介紹的方法制備含飽和氫氣的HC-A離體腎保存液。抽取4℃HC-A離體腎保存液200 mL充入一真空的密閉容器內(nèi)，向容器內(nèi)充入氫氣，維持0.4 MPa的壓力，6 h后腎保存液中的氫氣接近于飽和，采用氣相色譜分析法測(cè)定其中氫氣的濃度，確保氫氣的濃度大于0.60 mmol·L-1，制備后的腎保存液于4℃常壓保存，于2 d內(nèi)使用。

1.3 動(dòng)物分組及模型建立 健康雄性Wistar大鼠24只（中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），周齡8~10周，體質(zhì)量200~250 g，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為3組（n=8）。（1）對(duì)照組（H1組）：腹腔注射5%的水合氯醛溶液（60 mg·kg-1）麻醉大鼠，經(jīng)腹部脫毛及碘伏消毒后，鋪無菌手術(shù)單，沿腹正中線逐層打開腹腔，鈍性游離雙側(cè)腎臟，切除右腎后用溫生理鹽水沖洗腹腔，縫合腹部切口。術(shù)中鋪加溫毯，監(jiān)測(cè)大鼠肛溫，維持大鼠體溫高于37.0℃；（2）普通腎保存液組（H2組）：麻醉方法及開腹操作同H1組，開腹后充分游離雙側(cè)腎動(dòng)、靜脈，切除右腎，鈍性分離左側(cè)腎蒂上下方的腹主動(dòng)脈和下腔靜脈。用無損傷血管夾在左腎動(dòng)脈開口上、下方阻斷腹主動(dòng)脈，在左腎靜脈開口上、下方阻斷下腔靜脈，用0.7 mm×19.0 mm的動(dòng)脈留置針行腹主動(dòng)脈插管，拔出針芯并結(jié)扎固定套管，作為灌注通路；在下腔靜脈上做一約3 mm的缺口作為流出通路。用4℃普通HC-A腎保存液通過腹主動(dòng)脈套管對(duì)左腎行原位冷灌注，用吸引器及時(shí)吸凈流出的血液和保存液，灌注液總量10 mL，在2~3 min內(nèi)完成灌注。灌注完成后在近左側(cè)腎門處夾閉左腎動(dòng)、靜脈45 min，阻斷期間用7-0血管線縫合腹主動(dòng)脈和下腔靜脈的缺口，隨即移除腹主動(dòng)脈和下腔靜脈的血管夾。45 min后移除左腎腎蒂上的血管夾，恢復(fù)左腎血流，用溫生理鹽水沖洗腹腔后關(guān)腹；（3）含飽和氫氣腎保存液組（H3組）：麻醉及手術(shù)操作同H2組，灌注液及保存液采用自制的含飽和氫氣的HC-A腎保存液，按同樣方法灌注后關(guān)腹。

1.4 樣本的采集和觀察指標(biāo)的測(cè)定

1.4.1 腎功能檢查 H1組大鼠于切除右腎24 h后，H2和H3組于再灌注24 h后經(jīng)下腔靜脈取血2 mL，4000 r/min離心5 min，檢測(cè)各組大鼠血清BUN和Cr的濃度以評(píng)價(jià)腎功能。

1.4.2 氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡檢測(cè) 抽取靜脈血標(biāo)本后立即處死大鼠，切取左腎，取左腎背面上半個(gè)腎組織，剝除結(jié)締組織后在4℃生理鹽水中沖洗干凈，稱取0.5 g腎臟組織塊，與生理鹽水4.5 g制作組織勻漿，采用MDA含量和SOD活性試劑盒測(cè)定組織勻漿中MDA含量和SOD活性以評(píng)價(jià)氧化應(yīng)激的水平；比色法檢測(cè)caspase-3活性以評(píng)價(jià)細(xì)胞凋亡的水平，具體操作按試劑盒說明進(jìn)行。

1.4.3 形態(tài)學(xué)檢查 取左腎同一部位的部分腎組織，用10%甲醛溶液固定后石蠟包埋后，切成4 μm薄片，行HE染色后于光學(xué)顯微鏡下觀察腎組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腎功能檢查 如表1所示，與H1組相比，H2、H3組BUN和Cr水平升高（P<0.05）；與H2組相比，H3組BUN和Cr水平降低（P<0.05）。

表1 各組大鼠血清中BUN、Cr水平（±s）Tab 1 Levels of BUN and Cr in H1，H2and H3groups（±s）

表1 各組大鼠血清中BUN、Cr水平（±s）Tab 1 Levels of BUN and Cr in H1，H2and H3groups（±s）

與 H1組比較，abP<0.05；與 H2組比較，bP<0.05

組別nBUN（/mmol·L-1）Cr（/μmmol·L-1）H185.77±1.2450.69±7.13 H2817.91±1.45a155.62±8.23a H3810.76±0.97ab106.01±7.74ab

2.2 氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡檢測(cè) 如表2所示，與H1組相比，H2、H3組腎組織中 MDA含量和 caspase-3活性升高（P<0.05），SOD活性降低（P<0.05）；與H2組相比，H3組腎組織中MDA含量和caspase-3活性降低（P<0.05），SOD活性升高（P<0.05）。

表2 各組大鼠腎組織中MDA含量和SOD、caspase-3活性（±s）Tab 2 MDA level,SOD and caspase-3 activity in renal tissue inH1,H2and H3group（±s）

表2 各組大鼠腎組織中MDA含量和SOD、caspase-3活性（±s）Tab 2 MDA level,SOD and caspase-3 activity in renal tissue inH1,H2and H3group（±s）

與 H1組比較，abP<0.05；與 H2組比較，bP<0.05

組別nMDA（/nmol·mg蛋白-1）SOD（/NU·mg蛋白-1）caspase-3活性H186.00±1.18132.36±5.071.00±0.20 H2816.87±1.04a62.52±5.23a1.58±0.31a H389.71±1.00ab100.27±7.19ab1.31±0.01ab

2.3 形態(tài)學(xué)檢查 各組大鼠腎組織經(jīng)HE染色后于光鏡下觀察結(jié)果，如圖1所示：H1組腎組織形態(tài)結(jié)構(gòu)未見明顯異常；H2組可見大量腎小管上皮細(xì)胞腫脹，出現(xiàn)明顯空泡，上皮細(xì)胞壞死脫落，腎小管結(jié)構(gòu)破壞；H3組病理改變較H2組明顯減輕，腎小管的病理改變以擴(kuò)張為主，僅少數(shù)腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)空泡，未見明顯的結(jié)構(gòu)破壞。

圖1 各組大鼠腎組織形態(tài)學(xué)改變（HE，×200）Fig 1 The pathological changes of kidney in H1,H2and H3groups(HE,×200)

3 討論

移植腎在恢復(fù)血液灌注后會(huì)不可避免地產(chǎn)生I/R損傷。在手術(shù)過程中，移植腎先后經(jīng)歷了熱缺血和冷缺血的過程，大量實(shí)驗(yàn)研究采用了夾閉大鼠腎動(dòng)脈一段時(shí)間后再開放的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，即熱I/R損傷模型，因?yàn)槿鄙倭死淙毖倪^程，所以這些模型更適合于休克的研究，不能很好地模擬腎移植過程；而對(duì)于大鼠腎移植模型，因需要進(jìn)行血管吻合，操作復(fù)雜，術(shù)后血管狹窄、血栓形成等并發(fā)癥多，同時(shí)增加了排斥反應(yīng)的干擾。本研究所選用的大鼠冷缺血再灌注模型是以Takada等報(bào)道的原位腎臟冷灌注模型為基礎(chǔ)，增加了冷缺血過程，相對(duì)于大鼠腎移植模型具有操作簡單、血管損傷少、體循環(huán)影響小以及避免排斥干擾等優(yōu)點(diǎn)，能較好地模擬大鼠腎移植的I/R過程。

氫氣是具有還原性的雙原子氣體，分子量小，電荷中性，且具有良好的脂溶性，容易透過各種生物膜。2007年，Ohsawa等[6]首次報(bào)道氫氣能夠選擇性地與羥自由基（OH·）和過氧亞硝酸陰離子（ONOO-）發(fā)生直接反應(yīng)，具有選擇性抗氧化的生物效應(yīng)。由氧自由基介導(dǎo)的氧化損傷和炎性損傷是導(dǎo)致I/R損傷的主要病理基礎(chǔ)之一。I/R過程中，氧自由基生成增多，在介導(dǎo)氧化損傷的氧自由基中，以O(shè)H·和ONOO-的毒性最強(qiáng)，是導(dǎo)致I/R損傷的重要介質(zhì)。本研究結(jié)果顯示，與普通腎保存液組相比，含飽和氫氣腎保存液組MDA水平降低，SOD活性升高，提示應(yīng)用含飽和氫氣腎保存液后大鼠腎臟的氧化應(yīng)激水平降低，可能是由于氫氣的選擇性抗氧化作用，使得OH·和ONOO-數(shù)量減少，從而減輕了由其引發(fā)的氧化損傷。

腎小管上皮細(xì)胞凋亡是腎功能損害的重要環(huán)節(jié)，與多種腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。capase-3是細(xì)胞凋亡過程中的一個(gè)關(guān)鍵酶，在腎小管上皮細(xì)胞的凋亡中起重要作用，其活性的高低能間接反映組織細(xì)胞的凋亡程度。本研究的結(jié)果顯示，與普通腎保存液組相比，含飽和氫氣腎保存液組的腎組織中caspase-3活性明顯降低，提示細(xì)胞凋亡水平降低，同時(shí)腎功能也明顯改善，光鏡下觀察腎小管上皮細(xì)胞的損傷和腎小管結(jié)構(gòu)破壞的程度亦明顯減輕。在腎臟I/R損傷過程中，氧自由基可激活多種炎癥細(xì)胞，釋放大量促炎細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）和白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）等[7]。增多的炎性因子誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞的活化和遷移滲透，從而引起腎臟局部及全身的炎性反應(yīng)，導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞的壞死和凋亡。有報(bào)道稱，TNF-α對(duì)腎臟近端腎小管上皮細(xì)胞的活性有明顯抑制作用并呈劑量依賴性，最終可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[8]。IL-6在腎臟再灌注后的炎性損傷中同樣具有重要作用。腎小管上皮細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞以及部分T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞都表達(dá)IL-6受體，I/R過程中大量的IL-6與受體結(jié)合后能引起腎小管上皮細(xì)胞的凋亡，同時(shí)活化上述免疫細(xì)胞，加重組織損傷[9]。有臨床研究也證明，IL-6能明顯加重腎移植過程中的腎臟的I/R損傷[10]。Janus激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子（JAK/STAT）信號(hào)通路是TNF-α和IL-6導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的共同途徑，二者與腎小管上皮細(xì)胞的相應(yīng)受體結(jié)合后促進(jìn)凋亡相關(guān)分子capase-1和capase-3等表達(dá)增多，繼而誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。結(jié)合本研究的結(jié)果，氫氣減輕腎小管上皮細(xì)胞凋亡可能是通過作用于上述信號(hào)通路而實(shí)現(xiàn)的。氫氣的選擇性抗氧化作用清除了大量具有細(xì)胞毒性的氧自由基，并減輕了由其引發(fā)的炎癥反應(yīng)，促炎細(xì)胞因子的釋放減少，使JAK/STAT信號(hào)通路介導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡程度明顯減輕。

綜上所述，氫氣用于移植腎臟的灌注和保存時(shí)表現(xiàn)出明顯的抗氧化和抗凋亡的作用，同時(shí)HC-A離體腎保存液是國內(nèi)腎移植手術(shù)時(shí)常用的器官保存液，用其制備含飽和氫氣的腎保存液過程簡單，成本低廉，有望為移植器官的保存提供新的途徑。

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