許 峰 查長(zhǎng)春

（1 復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，上海 200433；2 江蘇省弗泰生物科技有限公司，江蘇 泰州 225316）

火棘果紅色素提取物的體內(nèi)免疫活性研究

許 峰1查長(zhǎng)春2

（1 復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，上海 200433；2 江蘇省弗泰生物科技有限公司，江蘇 泰州 225316）

目的研究火棘果紅色素提取物對(duì)環(huán)磷酰胺所致免疫低下模型小鼠免疫功能的調(diào)節(jié)作用，為其在畜牧養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。方法采用腹腔注射環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）復(fù)制免疫功能低下小鼠模型，并考察不同劑量火棘果紅色素提取物對(duì)免疫抑制小鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、腹腔吞噬細(xì)胞吞噬功能、血清溶血素生成及溶血空斑形成的影響。結(jié)果火棘果紅色素提取物中、高劑量組能顯著提高免疫功能低下小鼠的臟器指數(shù)，增強(qiáng)腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能，促進(jìn)溶血素水平及溶血空斑的形成。結(jié)論火棘果紅色素提取物具有良好的免疫活性。

火棘果紅色素提取物；體內(nèi)；免疫活性

本研究選用中藥火棘為研究對(duì)象，研究火棘果紅色素提取物對(duì)小鼠免疫活性的影響，進(jìn)而為火棘果在畜禽飼養(yǎng)中的疾病防治應(yīng)用提供理論依據(jù)。火棘（Pyracantha fortuneana）為薔薇科蘋果亞科火棘屬常綠野生灌木或小喬木果樹植物，是一種豐富的天然資源，在湖南、河南、陜西、四川等地分布廣，產(chǎn)量大?；鸺粌H營(yíng)養(yǎng)豐富、具有很高的食用價(jià)值，火棘的根、皮、葉、果具有“生津止渴、清熱解毒、收斂止瀉”的功效，其果用于療瘡毒、治陰虛、止瀉痢等藥用功效早已被民間所證實(shí)?；鸺t色素是從天然火棘果中提取而得，屬花青素類?；ㄇ嗨卮蠖嗌珴甚r艷，不僅具有較好的著色效果，而且無毒無誘變作用，除作為食品、化妝品的著色劑外，它還具有抗氧化、抑制癌細(xì)胞入侵、抗炎抗病毒、保護(hù)肝臟、心腦血管以及神經(jīng)系統(tǒng)等多種藥理活性[1-2]。研究表明，火棘果紅色素具有清除自由基活性[3]，體內(nèi)免疫活性與抗氧化作用密切相關(guān)，火棘果紅色素體內(nèi)抗免疫活性的研究未見報(bào)道，本文系統(tǒng)研究了火棘果紅色素提取物體內(nèi)免疫活性，為火棘果的應(yīng)用開發(fā)奠定研究基礎(chǔ)。

1 材 料

1.1 儀器

UV-2802型紫外—可見分光光度計(jì)（尤尼柯（上海）儀器有限公司）；JJ500型精密電子天平（美國雙杰克兄弟（集團(tuán)）有限公司ā常熟雙杰測(cè)試儀器廠）；TA25組織勻漿機(jī)（IKA）；101-1數(shù)顯電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海浦東躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；RE-5299型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；HH-S型水浴鍋（鞏義市予華儀器廠）；BH-2型顯微鏡（Olympus）；TGL-16G臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；ALPHA2-4LSC冷凍干燥機(jī)（christ）。

1.2 試劑

火棘果（泰州職業(yè)技術(shù)學(xué)院校園內(nèi)采集）；環(huán)磷酰胺（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)為11051022，英文縮寫為CTX）；生理鹽水（徐州第五制藥廠生產(chǎn)，批號(hào)為2011020701）；肝素鈉注射液（江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)，2mL：2500單位）；95%醫(yī)用級(jí)酒精；其余試劑均為分析純。

1.3 動(dòng)物

清潔級(jí)昆明種小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量18～22g（上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司），生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（滬）2002-0010號(hào)；豚鼠：健康豚鼠；雞：健康家雞。

2 方 法

2.1 火棘果紅色素提取物的提取[1,3]

取干燥火棘果10克，用90mL70%的酸性乙醇溶液，pH=3在40℃水浴中提40min，提取3次，抽濾合并后的到紅色提取液，將提取液在50℃下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮得火棘果紅色素提取物浸膏，50℃干燥得深紅色固體提取物，即為火棘果紅色素提取物。按下公式計(jì)算火棘果紅色素提取物提取得率：火棘果紅色素提取物得率（%）=提取物質(zhì)量（g）/干果質(zhì)量（g）×100%。

2.2 火棘果紅色素提取物免疫活性測(cè)定

2.2.1 雞紅細(xì)胞懸液的制備[4]

取新鮮雞血約10mL，以肝素生理鹽水抗凝，加入生理鹽水10mL，充分混勻，1500r/min離心15min，沉淀層紅細(xì)胞加入生理鹽水10mL，洗滌2～3次。用生理鹽水將洗凈的紅細(xì)胞配制成5%（v/v）濃度，臨用前配制。

2.2.2 豚鼠血清補(bǔ)體制備

分別取5只不同窩豚鼠的血，分離后合并血清，用生理鹽水把血清配成10%（v/v），備用。

2.2.3 小鼠分組、造模及給藥[5-7]

將小鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，雌雄各半，分為正常組、模型組和給藥組（火棘果紅色素高、中、低劑量組）。正常組每天灌胃生理鹽水0.4mL和腹腔注射生理鹽水0.4mL，模型組每天灌胃生理鹽水0.4mL和腹腔注射CTX20mg/kg，各給藥組分別灌胃給藥不同濃度的火棘果紅色素提取物溶液0.4mL（高、中、低劑量分別為800、400、200mg/kg）同時(shí)腹腔注射CTX 20mg/kg。

2.2.4 測(cè)定臟器指數(shù)[8]

按照“2.2.3”項(xiàng)下的方法，不間斷給藥7d，把小鼠脫頸椎致死，在無菌條件下，將脾臟、胸腺器官剝?nèi)?，然后稱定質(zhì)量，按照公式（1）計(jì)算臟器指數(shù)。

臟器指數(shù)/（mg/g）=器官質(zhì)量/體質(zhì)量（1）

2.2.5 測(cè)定腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能[9]

按照“2.2.3”項(xiàng)下方法：分組、造模和給藥，7d后，分別給小鼠在腹腔部位注射5%的雞紅細(xì)胞生理鹽水懸液0.5mL（質(zhì)量份數(shù)）進(jìn)行免疫，10h后處死小鼠，將腹部皮膚剪開，用2mL生理鹽水注射沖洗腹腔，將沖洗液滴于2片載玻片上，放入托盤內(nèi)，30min恒溫孵育（37℃），用生理鹽水除去沒有被吞噬的雞紅細(xì)胞和其他細(xì)胞，吹干，并用甲醇/丙酮（1∶1）溶液固定5min，晾干，瑞氏染液染色，油鏡下觀察，計(jì)數(shù)100個(gè)吞噬細(xì)胞，按式（2）、（3）計(jì)算巨噬細(xì)胞吞噬率及吞噬指數(shù)。

吞噬率（%）=（吞有雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)/巨噬細(xì)胞總數(shù)）× 100%（2）；吞噬指數(shù)=被吞噬的雞紅細(xì)胞數(shù)/巨噬細(xì)胞總數(shù)（3）

2.2.6 測(cè)定溶血素水平[9]

按照“2.2.3”項(xiàng)下的方法分組、造模和給藥。第1天給藥，用5%的雞紅細(xì)胞混懸液0.2mL給每只小鼠腹腔注射進(jìn)行免疫。最后一次給藥后40min，采用摘眼球的方法取血、離心，用生理鹽水稀釋血清100倍。將10%的豚鼠新鮮血清0.5mL、5%的雞紅細(xì)胞懸液0.5mL和稀釋血清1mL、混勻，37℃保溫30min，在冰水浴中使反應(yīng)停止，離心，取上清，540nm處測(cè)定吸光度（A）值。

2.3 數(shù)據(jù)的處理

采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、統(tǒng)計(jì)和分析，分析結(jié)果都以（χ—±s）表示，組與組間比較采用方差分析和t檢驗(yàn)。

3 結(jié) 果

3.1 火棘果紅色素提取物提取得率

火棘果紅色素提取物的得率為30.1%。

3.2 火棘果紅色素提取物對(duì)免疫抑制小鼠免疫器官指數(shù)的影響

與正常組相比，模型組小鼠臟器指數(shù)均顯著降低（P＜0.01），免疫抑制模型造模成功。與模型組相比，火棘果紅色素提取物中、高劑量組對(duì)胸腺的保護(hù)作用差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）；中、高劑量組對(duì)脾臟的保護(hù)作用差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），表明火棘果紅色素提取物對(duì)免疫抑制小鼠免疫器官有良好的保護(hù)作用。

3.3 火棘果紅色素提取物對(duì)免疫抑制小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響

模型組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞對(duì)雞紅細(xì)胞的吞噬指數(shù)和吞噬百分率均低于正常組（P＜0.05），說明成功建立小鼠免疫抑制模型。在和模型組相比的情況下，火棘果紅色素提取物高劑量組能夠明顯提高小鼠腹腔巨噬細(xì)胞對(duì)雞紅細(xì)胞的吞噬指數(shù)和吞噬率（P＜0.05），中、低劑量組提高作用不太大，表明火棘果紅色素提取物對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能有提高作用。

3.4 火棘果紅色素提取物對(duì)免疫抑制小鼠體液免疫功能的影響

與正常組相比，模型組溶血素水平顯著下降，表明免疫抑制模型建立成功。與模型組相比，火棘果紅色素提取物中劑量組能顯著促進(jìn)免疫抑制小鼠溶血素生成（P＜0.05），高劑量組有極顯著性差異（P＜0.01），表明，火棘果紅色素提取物能顯著提高免疫抑制小鼠的體液免疫功能。結(jié)果見表1。

表1 火棘果紅色素提取物對(duì)免疫抑制小鼠溶血素、溶血空斑形成的影響

4 討 論

本文選用火棘果中的火棘果紅色素提取物為研究對(duì)象，研究其對(duì)小鼠免疫活性的影響，以期為火棘果的現(xiàn)代應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。因火棘果紅色素含量測(cè)定干擾因素較多，目前沒有比較成熟的含量測(cè)定方法，故本文以火棘果紅色素提取物為研究對(duì)象，研究其在體內(nèi)的免疫活性。劑量選擇的依據(jù)：研究表明火棘果紅色素在濃度為1.8mg/mL時(shí)具有顯著抗氧化能力[3]，在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，本課題體內(nèi)免疫活性研究采用約10倍濃度作為中等劑量，據(jù)此設(shè)計(jì)高中低劑量為800mg/mL、400mg/mL和200mg/mL。

本文采用臨床抗腫瘤的基礎(chǔ)藥物環(huán)磷酰胺進(jìn)行動(dòng)物機(jī)體免疫系統(tǒng)損傷模型試驗(yàn)，考察了不同劑量火棘果紅色素提取物對(duì)環(huán)磷酰胺導(dǎo)致的小鼠免疫功能低下的修復(fù)功能。動(dòng)物的主要免疫器官是胸腺和脾臟，CD4

+T細(xì)胞分化和發(fā)育成熟的主要場(chǎng)所是胸腺，而動(dòng)物進(jìn)行機(jī)體免疫應(yīng)答的主要場(chǎng)所是脾臟，它們與細(xì)胞免疫、體液免疫關(guān)系非常密切，胸腺和脾臟的結(jié)構(gòu)、功能的正常運(yùn)行，對(duì)于維護(hù)機(jī)體的免疫功能非常重要。在本實(shí)驗(yàn)中，環(huán)磷酰胺致小鼠的免疫功能低下模型中，火棘果紅色素提取物中、高劑量均能明顯提高免疫器官的功能；此外，中、高劑量的火棘果紅色素提取物對(duì)提高腹腔吞噬細(xì)胞的吞噬能力具有顯著作用；高劑量的火棘果紅色素提取物可促進(jìn)血清溶血素及溶血空斑形成，并呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性。表明火棘果紅色素提取物是一種優(yōu)良的免疫調(diào)節(jié)劑，故利用火棘果進(jìn)行疾病防治藥物的研制具有重要的開發(fā)前景。

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B

1671-8194（2013）18-0097-02