鄢遠(yuǎn)會，戚南山，廖申權(quán)，李 娟，吳彩艷，呂敏娜，孫銘飛＊，楊亮宇

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物衛(wèi)生研究所，廣東 廣州 510640）

雞球蟲病是一種全球流行且嚴(yán)重危害養(yǎng)雞業(yè)生產(chǎn)的重要寄生蟲病，目前仍主要依賴各種抗球蟲藥物進(jìn)行防治，但由于廣泛產(chǎn)生的球蟲抗藥性問題，急需新的抗球蟲藥物出現(xiàn)[1]。

沉默信息調(diào)節(jié)因子2（Sir2）是廣泛存在于從古細(xì)菌到人類的多種生物細(xì)胞中，具有依賴NAD＋的去乙酰化酶活性和ADP－核糖轉(zhuǎn)移酶活性的一類組蛋白去乙?；福╤istone deacetylases，HDACs）[2]。研究表明，Sir2參與調(diào)節(jié)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，影響細(xì)胞的衰老，在染色質(zhì)沉默、姐妹染色單體調(diào)聚、基因調(diào)控、代謝調(diào)節(jié)和抑制細(xì)胞凋亡等一系列細(xì)胞生物活動過程中起重要作用[3－6]。O－acetyl－ADP－ribose（OAADPr）是Sir2調(diào)節(jié)去乙?；磻?yīng)的產(chǎn)物之一，OAADPr被證實(shí)能阻止或延遲海星胚胎的細(xì)胞分裂，研究證實(shí)通過刺激Sir2p／Sir3p／Sir4p復(fù)合物的形成可導(dǎo)致酵母重要功能基因沉默[3]。近年來，在惡性瘧原蟲（Plasmodium falciparum）、克氏錐蟲（Trypanosoma cruzi）、剛地弓形蟲（Toxoplasma gondii）、犬新孢子蟲（Neospora caninum）和利什曼原蟲（Leishmaniaspp）等寄生蟲中也相繼發(fā)現(xiàn)Sir2蛋白，并發(fā)現(xiàn)其在寄生蟲抗原變異、端粒沉默和DNA修復(fù)等生理過程中發(fā)揮重要作用[3，7－8]。鑒于低等生物與其宿主在 Sir2基因序列和蛋白結(jié)構(gòu)上的差異，近年來被作為抗病原微生物藥物靶標(biāo)成為了研究的熱點(diǎn)，并以此為靶標(biāo)，已篩選獲得了一系列具有抗P.falciparum活性的先導(dǎo)化合物[9－12]。

但目前尚未見艾美耳球蟲沉默信息調(diào)節(jié)因子2蛋白（EtSir2）功能、編碼基因研究的報(bào)道。鑒于此，本研究擬以對雞危害最為嚴(yán)重的柔嫩艾美耳球蟲（E.tenella）為研究對象，通過電子克隆策略注釋其基因序列，并進(jìn)行克隆以及重組表達(dá)，為進(jìn)一步研究EtSir2的功能，以及以其為靶標(biāo)篩選新型抗球蟲藥物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 蟲株 E.tenella（Houghton株）第2代裂殖子cDNA文庫由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所寄生生物學(xué)研究室制備并保存。

1.1.2 菌株和載體 E.coli DH5α、E.coli JM109以及E.coli Rosetta菌株均由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所寄生生物學(xué)研究室保存；pMD18－T Vector和pET43a載體購于寶生物工程（大連）有限公司。

1.1.3 試劑 乙二胺四乙酸（EDTA）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、氨芐青霉素（Amp）、異丙基－β－D－硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、溴化乙錠（EB）、溴酚蘭為上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品；DNA Marker DL 2000（MD114）為天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品；瓊脂糖和RTPCR試劑盒為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；E.Z.N.A.質(zhì)粒小量制備試劑盒和DNA膠回收試劑盒為奧美德諾（北京）基因科技有限公司產(chǎn)品；2×Taq PCR MasterMix為天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品；TaKaRa LA TaqTM為TaKaRa公司產(chǎn)品。T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶為上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品。750mL／L乙醇溶液，用無核酶水依試驗(yàn)中所需的量現(xiàn)配制；磷酸鹽緩沖液（PBS），TAE核酸電泳緩沖液：參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》配制。

1.1.4 培養(yǎng)基 LB液體培養(yǎng)基，LB瓊脂培養(yǎng)基，SOC液體培養(yǎng)基，參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》配制。

1.1.5 引物

1.1.5.1 克隆Sir2基因所需引物 根據(jù)注釋的E.tenella Sir2基因序列，采用Premier Primer 6.0軟件設(shè)計(jì)需要合成的引物，由invitrogen公司合成：

上游引物Sir2F：5′－ATGTGCACGCCGCACACAATC－3′

下游引物Sir2R：5′－TCATTCATTTTCCCCTGGGGGT－3′

1.1.5.2 表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建所需引物 上游引物：Sir2eF： 5′－GGCGAATTCATGGGCCAGTGGTTAACATACATGCG－3′，下游引物：Sir2eR：5′－GGCGTCGACTCATTCATTTTCCCCTGGGGGT TC－3′。

1.2 方法

1.2.1 Et Sir2基因注釋 在NCBI和相關(guān)生物學(xué)網(wǎng)站（http：／／www.toxodb.org ，http：／／plasmodb.org／）搜索與E.tenella進(jìn)化關(guān)系較近物種P.falciparum和T.gondii Sir2的基因序列，利用在線工具ClustalW 進(jìn)行多重序列比對分（http：／／www.ebi.ac.uk／tools／clustalW），找到相對保守的氨基酸序列。利用保守的氨基酸序列作為種子序列，搜索球蟲基因數(shù)據(jù)庫 www.sanger.ac.uk／Projects／E tenella／，預(yù)測拼接Et Sir2基因序列。

1.2.2 PCR擴(kuò)增Sir2全長ORF序列 以cDNA文庫為模板，Sir2F，Sir2R 為引物，TaKaRa LA TaqTM酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件：94℃5min；94℃30s，60℃80s，72℃1min，循環(huán)35次；72℃延伸10min，退火溫度設(shè)定為每循環(huán)降低0.2℃。將PCR產(chǎn)物切膠回收后連接至pMD18－T載體，再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入E.coli JM109克隆菌。挑取單菌落若干個，進(jìn)行菌落PCR鑒定，陽性菌送華大基因公司測序。

1.2.3 序列分析 利用在線翻譯工具對序列進(jìn)行分析。用在線工 具 SignalP 4.1Server（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／SignalP／）進(jìn)行信號肽序列分析，利用 TargetP 1.1Server（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／TargetP／）對Sir2進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測；利用在線工具TMHMM Server v.2.0（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／TMHMM／）進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域分析；利用在線工具ClustaiW2（http：／／www.ebi.ac.uk／Tools／msa／clustalw2／）進(jìn)行多重序列比對分析。ESyPred3DWeb Server 1.0（http：／／www.fundp.ac.be／sciences／biologie／urbm／bioinfo／esypred／）結(jié)合軟件SPDBV 4.10，模擬得出3D空間構(gòu)象。

1.2.4 原核表達(dá)載體的構(gòu)建 以上述測序正確的重組菌為模板，用Sir2eF和Sir2eR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將PCR回收產(chǎn)物及pET43a質(zhì)粒分別于37℃恒溫下用SalⅠ和EcoRⅠ雙酶切3h，酶切產(chǎn)物電泳鑒定。將回收的酶切產(chǎn)物于4℃連接過夜，轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，以Amp平板上的白色菌落為模板，進(jìn)行PCR鑒定篩選。對PCR陽性克隆進(jìn)行質(zhì)粒提取，雙酶切鑒定。將鑒定結(jié)果正確的菌送華大基因公司測序。

將測序正確的菌提質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至E.coli Rosseta菌，以Amp平板上的白色菌落為模板，進(jìn)行PCR篩選。

1.2.5 誘導(dǎo)表達(dá)與蛋白純化 將構(gòu)建的表達(dá)菌于37℃搖振培養(yǎng)，180r／min，當(dāng)OD600nm值為0.5時，加入IPTG至終濃度為1mmol／L誘導(dǎo)表達(dá)，轉(zhuǎn)移至16℃搖床160r／min培養(yǎng)18h。3500r／min離心收集沉淀，加入細(xì)胞裂解液重懸后進(jìn)行細(xì)胞超聲裂解，9000r／min高速離心并分別收集上清和沉淀，經(jīng)SDS－PAGE檢測目的蛋白的表達(dá)水平及可溶性。取上清溶液，借助AKTA purifier蛋白純化系統(tǒng)與Ni－NAT親和層析柱使目的蛋白得到分離。

2 結(jié)果

2.1 Et Sir2基因注釋結(jié)果

以比對的保守氨基酸序列為種子探針，對E.tenella基因數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Omin Blast分析，結(jié)果顯示EIMER－contig－00030494包括編碼 Et Sir2的基因序列，以 MacVector11.0為工具進(jìn)行分析，獲得Et Sir2完整編碼序列。ORF為1029bp，編碼342個氨基酸，其編碼的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為38ku左右。

2.2 PCR擴(kuò)增EtSir2全長ORF序列

以EtHoughton第2代裂殖子cDNA文庫為模板，用Sir2F和Sir2R引物首次擴(kuò)增得到EtSir2預(yù)測序列，采用10g／L瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果顯示擴(kuò)增獲得一條約1200bp的片段（圖1）。

圖1 EtSir2基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳分析Fig.1 Electrophoresis analysis of PCR products of EtSir2gene

2.3 Sir2序列分析

利用在線工具進(jìn)行信號肽、細(xì)胞亞定位以及跨膜結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果顯示EtSir2無信號肽序列，沒有明確的亞細(xì)胞定位，不含有跨膜結(jié)構(gòu)域。

利用在線工具ClustaiW2將EtSir2分別與剛地弓形蟲（T.gondii）、惡性瘧原蟲（P.falciparum）、間日瘧原蟲（P.vivax）、猴瘧原蟲（P.cynomolgi）、約氏瘧原蟲（P.yoelii）、犬新孢子蟲（N.caninum）、諾 氏 瘧 原 蟲 （P.knowlesi）、伯 氏 瘧 原 蟲 （P.berghei）、夏氏瘧原蟲（P.chabaudi chabaudi）、原雞（Gallus gallus）以及人類（Homo sapiens）進(jìn)行多重序列比對分析，結(jié)果顯示這些基因所編碼的氨基酸序列具有一定的相似性，各物種之間的相似性在24%～58%之間；構(gòu)建的分子進(jìn)化樹顯示，EtSir2與T.gondii和N.caninum處于同一進(jìn)化支上，進(jìn)化關(guān)系最為接近（圖2）。

圖2 不同物種Sir2種系進(jìn)化分析Fig.2 Phylogenetic analysis of Sir2sfrom different species

利用ESyPred3DWeb Server 1.0在線軟件對EtSir2進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)合軟件SPDBV 4.10，模擬得出3D空間構(gòu)象。預(yù)測EtSir2蛋白分為大小兩個亞基，存在NAD＋及Zn2＋的保守結(jié)合位點(diǎn)。α－螺旋（α－h(huán)elix）所占的比例較高為28.8%，擴(kuò)展鏈（Extended strand）的比例為20.2%，無規(guī)卷曲（Random coil）的比例為51%，三者交替分布形成EtSir2蛋白的二級結(jié)構(gòu)，如圖3。

圖3 預(yù)測的EtSir2三級結(jié)構(gòu)Fig.3 Predicted tertiary structure of EtSir2

2.4 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

2.4.1 EtSir2的PCR擴(kuò)增 以測序正確的克隆菌為模板，用Sir2eF和Sir2eR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用10g／L瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果顯示擴(kuò)增獲得一條約900bp的片段（圖4）。

2.4.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的雙酶切鑒定 對PCR鑒定的陽性克隆菌進(jìn)行質(zhì)粒提取，進(jìn)一步雙酶切鑒定重組質(zhì)粒（圖5）。鑒定結(jié)果正確的重組質(zhì)粒送廣東英俊公司進(jìn)行測序。

圖4 EtSir2基因序列的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳分析Fig.4 Electrophoresis analysis of PCR Products of EtSir2gene

圖5 pET43a－EtSir2的酶切鑒定Fig.5 Identification of pET43a－EtSir2by enzyme digestion

2.5 誘導(dǎo)表達(dá)與蛋白純化

將構(gòu)建好的pET43a－EtSir2轉(zhuǎn)化至E.coli Rosseta（DE3），37℃培養(yǎng)至OD值0.5時加入IPTG至終濃度為1mmol／L誘導(dǎo)表達(dá)，轉(zhuǎn)移至16℃搖床160r／min培養(yǎng)18h。將收集菌體重懸于細(xì)胞裂解液，在260W功率下超聲裂解15min。高速離心分離上清和沉淀，經(jīng)SDS－PAGE檢測目的蛋白的表達(dá)水平及可溶性，重組表達(dá)的蛋白大小約99ku，與預(yù)期一致（圖6）。

破碎細(xì)胞上清液通過Ni親和層析方法使目的蛋白得到分離（圖7）。

圖6 pET43a－EtSir2表達(dá)產(chǎn)物SDS－PAGE分析Fig.6 SDS－PAGE analysis of pET43a－EtSir2expressed in E.coli

3 討論

圖7 EtSir2蛋白的Ni－NTA純化Fig.7 Purification of EtSir2with Ni－NTA

組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶和組蛋白去乙酰化酶（HDACs）調(diào)節(jié)組蛋白的乙?；癄顟B(tài)，調(diào)控轉(zhuǎn)錄、DNA復(fù)制和修復(fù)的一類蛋白酶，廣泛存在于各類生物種[2]。目前依據(jù)其生化特性被分為三類，ClassⅠ和ClassⅡ類是依賴于Zn的去乙?；?，而ClassⅢ類則是依賴于輔酶NAD＋，本文所研究的EtSir2為ClassⅢHDACs，Sir2首先在酵母中被發(fā)現(xiàn)，是一種依賴NAD＋的去乙酰化酶，廣泛存在于古細(xì)菌到人類的多種生物細(xì)胞中[3，13]。早期，在哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)過程中，研究人員發(fā)現(xiàn)SIRT2作用于H4K16，H4K16去乙酰化是細(xì)胞進(jìn)入分裂期所必需。此外，North等發(fā)現(xiàn)，人SIRT2催化tublin和乙酰CoA合成酶的去乙?；?，提示其參與細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸、吞噬和有絲分裂過程[13]。隨后研究表明，SIR2參與了腫瘤細(xì)胞增殖的調(diào)控和細(xì)胞轉(zhuǎn)化，可能作為腫瘤抑制因子維持著細(xì)胞的正常形態(tài)[14]。蜜蜂表達(dá)分析研究表明可能參與蜂王表型的調(diào)控[15]。近年來，在P.falciparum、T.cruzi和利Leishmania spp等寄生蟲中也相繼發(fā)現(xiàn)Sir2蛋白，并證實(shí)是P.falciparum重要的毒力因子[7－8]。由于這類寄生蟲的Sir2在蛋白結(jié)構(gòu)上與其宿主具有明顯差異，也作為抗寄生蟲藥物研究的重要靶標(biāo)成為了研究的熱點(diǎn)。

近年來由于抗雞球蟲藥物的長期使用，產(chǎn)生了廣泛而嚴(yán)重的耐藥性，急需新的抗球蟲藥物出現(xiàn)[16]。鑒于此，本研究對E.tenella基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析，注釋拼接了E.tenella Sir2基因序列，開放閱讀框（ORF）為全長909bp，并成功克隆獲得EtSir2的全長ORF基因序列。編碼氨基酸序列與低等生物具有較高的相似性（42%～58%），說明寄生性原蟲擁有保守的Sir2序列，而與高等生物人和雞的氨基酸序列相似性僅有24%～25%。構(gòu)建的分子進(jìn)化樹也顯示，Et－Sir2與頂復(fù)門原蟲T.gondii和N.caninum處于同一進(jìn)化支上，而與高等生物進(jìn)化關(guān)系最遠(yuǎn)，說明EtSir2在蛋白結(jié)構(gòu)上與其宿主具有明顯差異，提示可作為抗寄生蟲藥物研究的重要靶標(biāo)。對EtSir2進(jìn)行在線工具分析，結(jié)果顯示EtSir2無信號肽序列，沒有明確的亞細(xì)胞定位，不含有跨膜結(jié)構(gòu)域，結(jié)合當(dāng)前文獻(xiàn)有關(guān)Sir2蛋白的報(bào)道，推測EtSir2為胞漿蛋白，在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用，可能與柔嫩艾美耳球蟲轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)。對EtSir2進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)預(yù)測并模擬3D空間構(gòu)象，結(jié)果顯示EtSir2蛋白分為大小2個亞基，存在NAD＋及Zn2＋的保守結(jié)合位點(diǎn)，推測EtSir2具有依賴NAD＋的去乙酰化酶活性。構(gòu)建pET43a－EtSir2重組表達(dá)載體，進(jìn)行原核表達(dá)并于可溶性上清液分離得到重組蛋白，推測該蛋白具有酶活性，在柔嫩艾美耳球蟲基因調(diào)控過程中發(fā)揮重要作用。

本研究獲得了Et Sir2的基因序列，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET43a－EtSir2并獲得了可溶性重組蛋白，為進(jìn)一步研究其生物學(xué)功能，以及以其作為靶標(biāo)篩選新型抗球蟲藥物奠定了基礎(chǔ)。

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