代平禮，周 婷，刁青云，王 強(qiáng)，吳艷艷

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所 農(nóng)業(yè)部授粉昆蟲(chóng)生物學(xué)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，北京100093）

已報(bào)道的蜜蜂外寄生螨主要有12 種，分別屬于瓦螨科（Varroidae）、厲螨科（Laelapidae）和蜂盾螨亞科（Acarapinae）［1］。瓦螨（Varroa）主要包括雅氏瓦螨（V.jacobsoni）、狄斯瓦螨（V.destructor）、恩氏瓦螨（V.underwoodi）和林氏瓦螨（V.rindereri），危害西方蜜蜂的主要為狄斯瓦螨（Varroa destructor）［2-3］。狄斯瓦螨包括不同基因型，危害西方蜜蜂（Apis mellifera）的是朝鮮基因型和日本／泰國(guó)基因型。朝鮮基因型不但分布廣泛，而且其致病性也比日本基因型強(qiáng)，所以對(duì)西方蜜蜂的危害也較日本基因型更嚴(yán)重［4］。目前，危害中國(guó)西方蜜蜂的狄斯瓦螨均為朝鮮基因型，未發(fā)現(xiàn)日本基因型［5］。阿根廷也是世界養(yǎng)蜂大國(guó)，主要飼養(yǎng)西方蜜蜂，2009年蜂群為297萬(wàn)群，瓦螨是危害蜂群的主要害蟲(chóng)［6］。鑒于此，本文對(duì)來(lái)自阿根廷的瓦螨樣本進(jìn)行mtDNA CO1基因序列分析和限制性?xún)?nèi)切酶酶切，來(lái)確定其基因型。

1 材料與方法

1.1 材料

瓦螨樣本來(lái)自阿根廷，將樣本編號(hào)并放入950mL／L乙醇中4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 總DNA提取 將蜂螨樣品在70mL／L乙醇中洗滌，用吸水紙吸干，放入40μL 2×WLB（worm lysis buffer）緩沖液中研碎，50℃孵育1h，100℃煮沸10min～15min，冷卻，加入40μL無(wú)菌純水。

1.2.2 PCR反應(yīng)引物 序列：WX-990422：ATTTATTTTGATTTTTTGGACA ；ZSF-20060123：AGCCCCTATTCTTAATACATAG 。反應(yīng)體系為50μL，其中25μL Mix，正反引物各1μL，DNA 模板10μL，純水13μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；94℃60s，50℃65s，72℃90s，30個(gè)循環(huán)；72℃5min。

1.2.3 序列測(cè)定 PCR產(chǎn)物經(jīng)12g／L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，送北京華大基因公司測(cè)序。

1.2.4 序列分析 序列分析采用Bio Edit Sequence Alignment Editor進(jìn)行分析，序列同源性比對(duì)在NCBI（http：／／www.ncbi.nlm.nib.gov／）Blast完成。

1.2.5 限制性?xún)?nèi)切酶酶切瓦螨樣品mtDNA CO1基因序列SacⅠ限制性?xún)?nèi)切酶消化，buffer L 2μL，SacⅠ1μL，純水8μL，PCR 產(chǎn)物7μL，37 ℃水浴2h；XhoⅠ限制性?xún)?nèi)切酶消化，buffer H 2μL，XhoⅠ1μL，純水8μL，PCR 產(chǎn)物7μL，37 ℃水浴2h，12g／L瓊脂糖凝膠電泳，分析酶切結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 PCR 擴(kuò)增結(jié)果

對(duì)目的片段進(jìn)行擴(kuò)增，PCR 產(chǎn)物用12g／L的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，24 個(gè)樣本擴(kuò)增片段大小均為458bp，無(wú)非特異性擴(kuò)增條帶，可以將擴(kuò)增的基因片段進(jìn)行測(cè)序（圖1）。

2.2 限制性?xún)?nèi)切酶酶切瓦螨樣品mtDNA CO1基因序列

蜂螨樣本CO1基因458bp片段僅能被限制性?xún)?nèi)切酶XhoⅠ切斷，不能被限制酶SacⅠ切斷（圖2），均為狄斯瓦螨朝鮮基因型。

2.3 mtDNA CO1基因片段測(cè)序及基因型鑒定

所有的測(cè)序結(jié)果與酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析結(jié)果相吻合，25份樣品均為狄斯瓦螨朝鮮基因型。

圖1 部分瓦螨樣品mtDNA CO1 基因PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR results of mt DNA CO1gene for part samples of Varroa

圖2 限制性?xún)?nèi)切酶酶切瓦螨樣品mtDNA CO1基因序列Fig.2 Restriction enzyme analyses of varroa mite mtDNA CO1gene

3 討論

狄斯瓦螨是對(duì)世界養(yǎng)蜂業(yè)危害最大的蜜蜂病蟲(chóng)害［7-13］。狄斯瓦螨已發(fā)現(xiàn)11 個(gè)基因型，危害西方蜜蜂的是朝鮮基因型和日本／泰國(guó)基因型，其中朝鮮基因型分布廣泛，危害歐洲、非洲、亞洲、美洲和新西蘭的西方蜜蜂，日本基因型只分布于日本、泰國(guó)和南北美洲［5］。本文研究結(jié)果顯示，阿根廷的25份來(lái)自西方蜜蜂的瓦螨樣本均屬于狄斯瓦螨朝鮮基因型。限制性?xún)?nèi)切酶酶切分析是鑒別狄斯瓦螨朝鮮基因型的最簡(jiǎn)便快捷的方法。只有狄斯瓦螨的朝鮮基因型僅能被限制性?xún)?nèi)切酶XhoⅠ切斷，不能被限制酶SacⅠ切斷。原因是朝鮮基因型的CO1基因458bp片段中，第167個(gè)堿基發(fā)生變異，由腺嘌呤（A）轉(zhuǎn)換為鳥(niǎo)嘌呤（G），失去了限制酶SacⅠ的識(shí)別位點(diǎn)GAGCTC，變?yōu)镚GGCTC，所以不能被切斷。限制性?xún)?nèi)切酶酶切分析結(jié)果與測(cè)序結(jié)果相吻合。狄斯瓦螨種內(nèi)可能還包括其他基因型。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，狄斯瓦螨的分類(lèi)學(xué)研究將更加深入，這將為其防治提供參考。

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