李敏思，伏小平，宋戰(zhàn)昀，付志金

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，甘肅 蘭州 730070；2.吉林出入境檢驗檢疫局；吉林 長春 130062；3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，吉林 長春 130118）

20世紀(jì)90年代指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）由Tuerk C和Gold L首次提出，此后核酸的研究進(jìn)入了新階段[1]。近年來，隨著SELEX技術(shù)的不斷完善，使得人們意識到DNA和RNA除了具有遺傳信息存儲和傳遞功能之外，在一定條件下可以憑借自身折疊形成的特定空間結(jié)構(gòu)與其他分子發(fā)生相互作用并且能夠發(fā)揮出超常的作用。利用該技術(shù)從特定的寡核苷酸庫中篩選出與目標(biāo)靶有特異性相互作用的寡核苷酸配體叫做適配體（aptamer）。適配體具有體外人工合成，不受免疫原性和免疫條件限制，變性與復(fù)性可逆，可定量檢測，高特異性，高親和力等特點。SELEX技術(shù)發(fā)展至今，已經(jīng)篩選到的病毒相關(guān)適配體主要包括人類免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus，HIV）的表面蛋白，肝炎病毒表面抗原、非結(jié)構(gòu)蛋白酶和核心抗原，流感病毒血凝素，嚴(yán)重急性呼吸綜合癥（Severe acute respiratory syndromes，SARS）病毒的解旋酶適配體等。目前，SELEX技術(shù)已經(jīng)廣泛地應(yīng)用到各項研究領(lǐng)域當(dāng)中，在病毒研究中表明適配體能夠識別和結(jié)合到病毒的特定部位，適配體可以作為功能阻斷劑從而影響病毒的復(fù)制、翻譯等步驟，從而阻止疾病的發(fā)生，也可特異性的識別被病毒感染的細(xì)胞，從而用于診斷，同樣可以替代抗體的特定功能，從而用于治療。本文主要針對SELEX技術(shù)在病毒核酸適配體檢測方面的最新研究進(jìn)展做如下綜述。

1 人類免疫缺陷病毒

人類免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus，HIV）是一種潛伏期極長的逆轉(zhuǎn)錄病毒，屬于慢病毒屬。隨著對HIV感染的深入研究以及核酸適配體篩選技術(shù)的發(fā)展，針對HIV表面蛋白已經(jīng)篩選出可以與HIV具有特異性并且高親和性結(jié)合的適配體，HIV表面蛋白包括調(diào)控蛋白Tat、結(jié)構(gòu)蛋白RT、結(jié)構(gòu)蛋白gp120，還篩選出來了抗原P24的適配體。由于體外培養(yǎng)病毒較困難，快速檢測病毒方法不多，生物傳感器方法不僅靈敏度高，而且可以在實際樣品實現(xiàn)快速檢測用于疾病的早期診斷和治療，因此利用這些適配體傳感器成為快速檢測病毒的一種新的手段。Rahim Ruslinda A等[2]首次利用金剛石場效應(yīng)晶體管（field effect transistor，F(xiàn)ET）作為RNA適配體傳感元件用來檢測實際樣本中的HIV Tat蛋白，根據(jù)Tat蛋白濃度變化與適配體結(jié)合所引起信號強弱變化進(jìn)行檢測HIV－1病毒，結(jié)果第一次證明了利用實際樣本中的HIV Tat蛋白的濃度可下降到1nmol／L。Liang Yu等[3]設(shè)計了HIV逆轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptase，RT）適配體信標(biāo)93del5dMB，在用1μmol／L的適配體的信標(biāo)中，有效的熒光信號隨著HIV RT的濃度從0.5μmol／L～5μmol／L增加而增加，當(dāng)信標(biāo)被傳遞到適配體的活細(xì)胞中時HIV RT瞬時表達(dá)，HIV RT可特異性標(biāo)識和成像，試驗證明該方法可應(yīng)用于艾滋病的HIV RT在活細(xì)胞中的完整成像。張寧等[4]利用SELEX技術(shù)以重組P24為靶標(biāo)篩選到能與HIV－P24特異性結(jié)合的兩條核酸適配體，為HIV診斷和治療提供了試驗基礎(chǔ)。Joshi R等[5]以HIV RT為靶分子，經(jīng)SELEX技術(shù)篩選出能夠特異性結(jié)合HIV RT的RNA適體。結(jié)果顯示，該適配體在體外和細(xì)胞培養(yǎng)中都能使病毒的復(fù)制減少90%～99%，能夠成功阻斷了HIV的逆轉(zhuǎn)錄過程，從而有效地抑制病毒感染，并且對HIV抗藥亞型同樣有較強的抑制作用，該試驗為HIV的基因治療提供了高效的方法。入侵宿主細(xì)胞的主要物質(zhì)是其表面的糖蛋白gp120和gp41。因此，目前研制針對HIV表面糖蛋白或者其受體以阻止HIV核心進(jìn)入細(xì)胞的藥物是當(dāng)前熱點問題[6]。Khati等對變異株病毒gp120部分保守區(qū)域篩選得到的2＇F－RNA型適配體能特異結(jié)合gp120，并能夠抑制HIV感染者外周血單核細(xì)胞的活性提高1000倍，其抑制活性不依賴于CD14與gp120的結(jié)合，為治療HIV奠定了新的基礎(chǔ)，該方法有望成為新一代治療HIV的藥物[7]通過利用篩選出來的核酸適配體與HIV高效特異的結(jié)合，綜合利用適配體傳感器、分子信標(biāo)等方法，為HIV的高效診斷，基因治療，新藥研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

2 肝炎病毒

肝炎病毒是引起病毒性肝炎的病原體。目前，針對甲、乙、丙型肝炎，已經(jīng)篩選出以核心蛋白、3C蛋白酶、囊膜糖蛋白E2、NS3螺旋酶為靶標(biāo)的核酸適配體，其中丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus，HCV）是一種具有脂質(zhì)囊膜的RNA病毒，核心蛋白在HCV感染1周后就會出現(xiàn)在血液中，因此，HCV核心蛋白適用于HCV窗口期檢測。針對肝炎病毒的早期檢測，張震等[8]建立了具有高靈敏度檢測HCV核心蛋白的核酸適配體－酶聯(lián)免疫方法，并且能夠成功的檢測出丙型肝炎病人血清中的核心蛋白，為丙型肝炎血清臨床診斷提供了快捷靈敏方便和低成本的新方法，打破了過去酶聯(lián)免疫方法不適合早期檢測 HCV的觀點。Chen Fang等[9]針對HCV活病毒進(jìn)行篩選，得到了靶向HCV包膜糖蛋白E2的適配體，可作為針對HCV患者的診斷試劑。Liu Jia等[10]在感染乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）的干細(xì)胞上面發(fā)現(xiàn)了HBV表面抗原（HBsAg），熒光標(biāo)記適配體靶目標(biāo) HBsAg A22，熒光顯微鏡觀察抗HBsAg結(jié)合到陽性細(xì)胞中，并且不與陰性細(xì)胞結(jié)合。結(jié)果證明，該方法可用于熒光適配體成像，首次證實了HBV特異性抗原適配體可用于HBV早期診斷和治療。針對抑制病毒的復(fù)制方面，Kikuchi K等[11]篩選出針對HCV的IRES區(qū)域Ⅱ的適配體，由于IRES對mRNA的轉(zhuǎn)錄非常重要，該適配體可以通過影響病毒的轉(zhuǎn)錄，從而抑制病毒的復(fù)制能力。詹林盛等[12]篩選出了與HCV NS3螺旋酶特異結(jié)合的寡核苷酸適配體，發(fā)現(xiàn)適配體在體外對HCV NS3的活性抑制達(dá)44%。針對研發(fā)相關(guān)藥物對肝炎的治療方面，柏文娟等[13]利用SELEX技術(shù)篩選出獲得性結(jié)合患者血清IgG抗體的特異性適體，結(jié)果顯示純化獲得的IgG抗體濃度為1.3mg／mL，對親和性吸光度值大于1.0的4個適體分析其中有3個適體對結(jié)核病組與健康對照組的檢測結(jié)果具有顯著差異，說明初步篩選獲得結(jié)核患者血清IgG抗體的適體有較高的特異性。Blaum B S等[14]使用1HNMR光譜從G－四鏈體中發(fā)現(xiàn)六核苷酸（G5T）可被視為最小的適配體，并特異性結(jié)合甲型肝炎病毒（Hepatitis A virus，HAV）3C蛋白酶，研究表明，特異性序列核酸蛋白與六核苷酸相互作用，這些復(fù)合物可能具有治療HAV的藥物相關(guān)性。

3 流感病毒

流感病毒是一種能夠造成人類及動物患流行性感冒的RNA病毒。目前已經(jīng)針對人類流感病毒和禽流感病毒篩選出了相應(yīng)的適配體，其中流感病毒表面血凝素（hemagglutinin，HA）蛋白是流感病毒最重要的抗原成分，同樣，也是抗體重要的結(jié)合位點，介導(dǎo)著病毒的初期感染。在抑制流感病毒感染方面，Subash C B等[15]篩選到了人類A型流感病毒RNA適配體，特異性結(jié)合H3N2HA，該適配體與HA蛋白的親和力比相應(yīng)的單克隆抗體高了15倍，能夠有效地抑制HA介導(dǎo)的膜融合，并且能夠鑒定不同亞型的A型流感病毒。Cheng Congsheng等[16]以H5N1的 HA蛋白為靶物質(zhì)，成功篩選到DNA適配體，該適配體具有特異性結(jié)合病毒HA蛋白的能力，同時可以有效抑制H5N1亞型流感病毒感染MDCK細(xì)胞，可以有效延緩病毒感染機體。在利用生物傳感器方面，Liu Xianggang等[17]基于DNA適配體和納米材料修飾電極構(gòu)建了電化學(xué)生物傳感器，成功用于檢測H5N1基因序列，檢測范圍5.0×10－12～1.0×10－9M，檢測限為4.3×10－13M。Wang Ronghui等[18]成功建立了水凝膠QCM傳感器用于檢測H5N1禽流感病毒，利用3種不同比例的水凝膠涂與傳感器上檢測H5N1禽流感病毒，結(jié)果顯示比例為1∶1的水凝膠檢測限為0.0128HAU（HA unit），從抽樣到檢測的時間為30min，證實了水凝膠QCM傳感器較抗體明顯降低了檢測限和檢測時間。在流感病毒藥物研發(fā)方面，Park S Y等[19]利用SELEX技術(shù)成功篩選出針對A型流感病毒H5亞型HA蛋白的RNA適配體HAS15－5，結(jié)合血凝抑制試驗，結(jié)果顯示出該適配體具有抑制病毒HA受體結(jié)合域的作用，具有開發(fā)針對H5亞型禽流感病毒藥物的潛能。

4 SARS病毒

SARS病毒是一種能夠快速傳播并且具有高傳染性的冠狀病毒，目前針對SARS病毒的核衣殼蛋白、N蛋白、NTPase解旋酶等為靶標(biāo)已經(jīng)成功篩選出了適配體并且應(yīng)用于抑制病毒復(fù)制、病毒檢測和治療等方面研究。在病毒檢測方面，Cho S J等[20]以SARS病毒核衣殼蛋白作為篩選靶物質(zhì)，成功構(gòu)建DNA文庫，結(jié)合ELISA與Western blot進(jìn)行分析鑒定，結(jié)果核衣殼蛋白的Kd值為4.93nmol／L±0.30nmol／L，證明了該單鏈DNA適配體能夠更有效地檢測SARS病毒核衣殼蛋白。Ahn D G等[21]篩選到了SARS病毒N蛋白的RNA適配體，該適配體能特異性結(jié)合N蛋白羧基末端，利用該適配體捕獲抗原，建立了檢測SARS病毒N蛋白適配體－抗體免疫測定方法，檢測結(jié)果為SARS病毒N蛋白最低限濃度為2pg／mL，因此提出并建立了適配體－抗體免疫測定法能夠特異、敏感的檢測SARS病毒。在抑制病毒復(fù)制方面，Jang K J等[22]針對SARS病毒NTPase解旋酶為靶標(biāo)，利用SELEX技術(shù)篩選得到主要位于二級結(jié)構(gòu)環(huán)區(qū)內(nèi)的含有10個～11個核苷酸的保守序列（AAAGGR（G）GAAG；R，嘌呤堿）RNA適配體，此RNA適配體抑制雙鏈DNA解旋酶活性的能力提高了85%，由于解旋酶是病毒復(fù)制所必須的酶，抑制了解旋酶的活性就能有效抑制SARS病毒的感染。Shum K To等[23]也針對SARS病毒解旋酶篩選到了2種構(gòu)型的DNA適配體，其中G－四分體的適配體對解旋酶沒有抑制作用，而非G－四分體適配體能特異性抑制解旋酶的活性。因此，適配體與病毒的活性酶在一定的空間結(jié)構(gòu)結(jié)合后就能在一定程度上抑制該酶的活性，從而抑制病毒復(fù)制，為病毒病治療提供了一條新的途徑。

5 其他

核酸適配體發(fā)展至今，適配體可以被用于治療任何由有害基因的表達(dá)而引起的疾病，利用不同的篩選技術(shù)已針對廣泛類型的病毒篩選出相應(yīng)的病毒適配體。例如，Bruno J G等[24]利用篩選到的針對口蹄疫病毒VP1特異性適配體，建立了檢測口蹄疫病毒的定量競爭性熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescence resonance energy transfe，F(xiàn)RET）方法，該方法可以在10min內(nèi)定量檢測到臟器25ng／mL～250ng／mL的口蹄疫病毒，這種定量檢測方法能快速、敏感、特異的檢測口蹄疫病毒。Murakami K等[25]以牛的朊病毒蛋白質(zhì)作為篩選靶物質(zhì)，體外構(gòu)建了RNA富集文庫，結(jié)果顯示通過蛋白質(zhì)印跡法證明適配體可以在牛腦組織勻漿中特異性的結(jié)合朊病毒蛋白，證實了該適配體可以應(yīng)用于朊病毒蛋白的檢測，能夠有效地診斷朊病毒感染。Ellenbecker M等[26]利用SELEX獲得了具有高親和力的裂谷熱病毒核衣殼蛋白的RNA適配體，成功構(gòu)建熒光生物傳感器，結(jié)果顯示該生物傳感器可以用來檢測抗病毒藥物的篩選。梁紅茹等[27]通過SELEX技術(shù)篩選出以狂犬病病毒感染的BHK－21為靶標(biāo)的5個單股DNA適配體，通過病毒滴度和實時熒光定量PCR表明5個適配體均能在細(xì)胞水平上抑制狂犬病病毒的增殖，并且T14和F34抑制效果最明顯，在一定范圍內(nèi)，適配體濃度越高，抑制病毒增殖效果越明顯，因此證實篩選出來的適配體可以抑制狂犬病病毒增殖，具有抗病毒治療的應(yīng)用前景。根據(jù)上述可知，適配體在病毒診斷和治療方面具有廣泛的應(yīng)用潛能，基于核酸適配體在病毒研究領(lǐng)域中的新技術(shù)具有良好的發(fā)展前景，越來越多的病毒核酸適配體將會被篩選。

6 小結(jié)與展望

核酸適配體在病毒檢測研究領(lǐng)域已經(jīng)取得了一些研究成果，這些成果有優(yōu)良的特性和樂觀的應(yīng)用前景。但是仍有許多不足之處，例如，核酸適配體制備昂貴并且不穩(wěn)定，很難獨立接近和穿透靶組織等系列問題。盡管現(xiàn)階段還沒有適配體毒副作用的報道，但是其安全性還有待證明，經(jīng)體外篩選獲得的核酸適配體可能在體內(nèi)試驗會失效，如何增加穩(wěn)定性、降低成本、加強靶向性，將是適配體在檢測中的主要挑戰(zhàn)。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)降低適配體結(jié)構(gòu)的柔性，提高熱穩(wěn)定性是核酸適配體具有體內(nèi)活性的必要條件。一些專家認(rèn)為鎖定核酸（locked nucleic acid，LNA）具有良好的熱力學(xué)穩(wěn)定性，現(xiàn)已成為研究的熱點[28]。目前，適配體和篩選方法作為檢測研究仍處于發(fā)展階段，但隨著適配體篩選技術(shù)和方法的不斷發(fā)展和完善，適配體的應(yīng)用范圍將不斷拓展，核酸適配體作為檢測應(yīng)用，將在檢測領(lǐng)域發(fā)揮更大的作用。越來越多的研究結(jié)果顯示，適配體以獨特的特性和SEL－EX過程的多樣化，相信其不久就可代替抗體適用于疾病的診斷和治療。

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