王 娟，孫 毅，程 龍，楊佳麗，石 娟，劉曉明，李 勇＊

（1.寧夏大學(xué)西部特色生物資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏 銀川 750021；2.寧夏大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，寧夏 銀川 750021）

灘羊是我國(guó)獨(dú)特的裘皮用綿羊品種，是國(guó)家二級(jí)動(dòng)物保護(hù)品種，2001年被農(nóng)業(yè)部列入第一批畜禽品種保護(hù)名錄。其所產(chǎn)二毛皮毛色潔白，光澤悅目，花穗美觀。灘羊羔羊肉脂肪分布均勻，肉質(zhì)細(xì)嫩，腥味小，是“寧夏羊肉”的代表，已享譽(yù)全國(guó)。寧夏是灘羊的主產(chǎn)區(qū)，在保護(hù)灘羊種質(zhì)資源特色的同時(shí)，對(duì)灘羊繁育性能的改良是寧夏灘羊產(chǎn)業(yè)發(fā)展的共性需求[1]。動(dòng)物體細(xì)胞克隆技術(shù)為動(dòng)物育種技術(shù)開辟了更廣泛的途徑，必將極大地提高動(dòng)物育種的效率。也為我區(qū)動(dòng)物育種產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供了技術(shù)支撐。

在體細(xì)胞核移植中體細(xì)胞必須在卵母細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行重編程以恢復(fù)其全能性，而卵母細(xì)胞的成熟度則會(huì)直接影響體細(xì)胞的重編程。所以，卵母細(xì)胞的體外成熟，作為體細(xì)胞核移植過程中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)被人們關(guān)注。自Edwards R G通過體外培養(yǎng)使小鼠、綿羊、猴、豬、牛、人[2]等哺乳動(dòng)物的卵母細(xì)胞在體外獲得成熟后，許多科研工作者在卵母細(xì)胞的體外成熟上做了大量的工作，通過在卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)液中添加血清[3]、雌激素[4]、促卵泡素（folliclestimulating hormone，F(xiàn)SH）、促黃體素（luteinizing hormone，LH）[5]等物質(zhì)，使哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞體外成熟率得到不斷提高。隨著卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)日益成熟，體外成熟的卵母細(xì)胞正在廣泛應(yīng)用于體外受精，用于擴(kuò)繁優(yōu)良母畜。在體細(xì)胞核移植等胚胎工程的各個(gè)領(lǐng)域，卵母細(xì)胞的成熟的效果，成為用于動(dòng)物模型及生物反應(yīng)器的生產(chǎn)的基礎(chǔ)條件。但是，不同的物種在卵母細(xì)胞體外成熟中還存在一定的差異，而有關(guān)灘羊的卵母細(xì)胞成熟的研究尚未見到系統(tǒng)的報(bào)道，因此，本研究擬通過探討不同濃度的FSH和LH及人絕經(jīng)期促性腺激素（human menopausal gonaclotxopin，HMG）對(duì)灘羊卵母細(xì)胞體外成熟的影響，旨在建立灘羊卵母細(xì)胞體外成熟體系，為灘羊體細(xì)胞核移和灘羊分子育種和優(yōu)良種畜擴(kuò)繁奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 灘羊卵巢 從屠宰場(chǎng)采集剛屠宰的母羊卵巢，放于加有青鏈霉素生理鹽水的保溫瓶中，30℃，4h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 試劑 FSH、LH 和17β－E2購(gòu)自寧波第二激素廠，HMG購(gòu)自麗珠制藥公司；TCM199購(gòu)自Gibco公司；青霉素、鏈霉素購(gòu)自華北制藥股份有限公司；胎牛血清購(gòu)自HyClone公司；牛血清白蛋白（Bovine Serum Album，BSA），丙酮酸鈉，谷氨酰胺，表皮生長(zhǎng)因子，胰島素－轉(zhuǎn)鐵蛋白－亞硒酸鈉復(fù)合物Insulin－transferrin－sodium selenite media supplement，ITS），尿嘧啶，透明質(zhì)酸酶均購(gòu)自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 卵丘－卵母細(xì)胞復(fù)合體（cumulus oocyte complexes，COCs）的采集 收集到的卵巢用37℃的滅菌生理鹽水清洗1次，先剪去多余的脂肪和結(jié)締組織，再用生理鹽水沖洗3次～4次后，置于盛有采卵液培養(yǎng)皿中。切割法收集COCs細(xì)胞，將檢出的COCs分為分為 A，B，C 3級(jí)：A級(jí)，卵丘細(xì)胞完整，卵母細(xì)胞胞質(zhì)均勻；B級(jí)，卵丘細(xì)胞不完整，卵母細(xì)胞胞質(zhì)均勻；C級(jí)，卵母細(xì)胞裸露，或胞質(zhì)略有退化。選擇A級(jí)和B級(jí)進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.2 卵母細(xì)胞的體外成熟培養(yǎng) 將收集到的A級(jí)、B級(jí)COCs用洗卵液清洗3次～4次，然后置于預(yù)平衡2h～3h含1mL成熟液的U型皿中，進(jìn)行體外成熟培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為38.5℃，體積分?jǐn)?shù)為5%CO2，飽和濕度，培養(yǎng)22h～24h。

采卵液：TCM199＋2.5mg／mlL 肝素鈉＋50mL／L FBS；洗卵液：TCM199＋20mL／L FBS；基礎(chǔ)成熟液（maturation medium，MM）：TCM199＋10mg／mL BSA ＋100×ITS＋50ng／mL EGF ＋1.5μg／mL 17β－E2＋ 50 μg／mL尿嘧啶＋2.5mmol／mL谷氨酰胺＋1mmol／L丙酮酸鈉；卵母細(xì)胞成熟液（oocyte maturation medium，OM ）Ⅰ：MM＋100μg／mL FSH＋20μg／mL LH；OMⅡ：基礎(chǔ)成熟液＋200μg／mL FSH＋40μg／mL LH；OM Ⅲ：基礎(chǔ)成熟液 ＋300μg／mL FSH＋60μg／mL LH；OM Ⅳ：基礎(chǔ)成熟液＋0.05IU／mL HMG；OMⅤ：基礎(chǔ)成熟液＋0.1IU／mL HMG；OMⅥ：基礎(chǔ)成熟液＋0.15IU／mL HMG；OM Ⅶ：基礎(chǔ)成熟液＋0.2IU／mL HMG；基礎(chǔ)成熟液組即為對(duì)照組。收集到的卵母細(xì)胞分6組使用不同的培養(yǎng)液進(jìn)行體外成熟培養(yǎng)，同一試驗(yàn)組重復(fù)3次～5次。

1.2.3 卵母細(xì)胞的成熟判定 將成熟培養(yǎng)后的COCs置于含3g／L透明質(zhì)酸酶的D－PBS液內(nèi)，用移液器輕輕吹打以除去成熟卵母細(xì)胞表面的卵丘細(xì)胞。在體視顯微鏡下，以異物針撥動(dòng)卵母細(xì)胞進(jìn)行觀察，觀察第一極體是否排出，來判定卵母細(xì)胞成熟。

1.2.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 以成熟培養(yǎng)液不加激素為對(duì)照組，在成熟培養(yǎng)液中分別添加100μg／mL FSH＋20μg／mL LH、200μg／mL FSH＋40μg／mL LH、300μg／mL FSH＋60μg／mL LH、0.05IU／mL HMG、0.1IU／mL HMG、0.15IU／mL HMG、0.2IU／mL HMG等，不同激素濃度為試驗(yàn)組，將卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)研究不同激素濃度對(duì)卵母細(xì)胞體外成熟的影響。每組試驗(yàn)進(jìn)行5次避免人為因素造成的差異。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 結(jié)果用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 添加不同濃度FSH和LH時(shí)灘羊卵母細(xì)胞體外成熟結(jié)果

在成熟液中添加不同濃度的FSH和LH對(duì)灘羊卵母細(xì)胞體外成熟有不同程度的影響，COCs在體外培養(yǎng)22h時(shí)，都可以觀察到卵丘細(xì)胞不同程度的擴(kuò)散（圖1）。隨著添加激素濃度的升高，卵丘細(xì)胞擴(kuò)散度增加，其中擴(kuò)散直徑，空白對(duì)照（圖1A）＜OMⅠ（圖1B）＜OMⅠ（圖1C）＜OMⅢ（圖1D）。但試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)激素FSH＞300μg／mL，LH＞60μg／mL時(shí)，卵丘細(xì)胞的擴(kuò)散直徑不再增加，這表明，添加激素對(duì)灘羊卵母細(xì)胞的卵丘細(xì)胞細(xì)胞擴(kuò)散有著一定的影響作用。同時(shí)運(yùn)用imageJ2x軟件測(cè)定不同激素濃度下卵母細(xì)胞在卵丘細(xì)胞包裹中的投影計(jì)算激素對(duì)卵母細(xì)胞的影響。測(cè)定結(jié)果運(yùn)用SPSS軟件分析，結(jié)果表明不添加激素的對(duì)照組的擴(kuò)散距離與OMⅠ、OMⅡ和OMⅢ的擴(kuò)散距離差異性顯著。OMⅠ、OMⅡ和OMⅢ的擴(kuò)散距離差異性不顯著。但OMⅡ中的卵母細(xì)胞擴(kuò)增距離優(yōu)于OMⅠ和OMⅢ中的卵母細(xì)胞擴(kuò)增距離，如圖2顯示（擴(kuò)散直徑對(duì)應(yīng)圖1次序）。

另外，在灘羊卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)液中添加不相同濃度的FSH和LH對(duì)卵母細(xì)胞成熟率不同，成熟培養(yǎng)液中加入100μg／mL FSH和20μg／mL LH成熟率為57.9%，與對(duì)照組差異顯著（P＜0.05）。添加200μg／mL FSH和40μg／mL LH的OM Ⅱ成熟率為68.8%，與對(duì)照組差異顯著（P＜0.05）。添加300μg／mL FSH和60μg／mL LH的OMⅢ成熟率54.6%，與對(duì)照組差異顯著（P＜0.05）（表1）。OMⅡ的成熟率與OMⅠ和OMⅢ的成熟率差異顯著（P＜0.05）。該結(jié)果說明，成熟液中適度FSH和LH的濃度變化對(duì)灘羊卵母細(xì)胞體外成熟有著非常重要的影響，過高的激素濃度對(duì)卵母細(xì)胞的成熟有抑制作用。

圖1 FSH與LH對(duì)灘羊卵丘－卵母細(xì)胞復(fù)合體擴(kuò)散度的影響（40×）Fig.1 The effects of FSH and LH on Tan sheep cumulus－oocyte complexes in vitro（40×）

圖2 不同F(xiàn)SH和LH激素濃度卵母細(xì)胞的擴(kuò)散距離（擴(kuò)散直徑對(duì)應(yīng)圖1次序）Fig.2 The oocyte diffusion distance（Diffusion diameter corresponding figure 1order）in different FSH and LH concentrations

2.2 添加HMG時(shí)卵母細(xì)胞體外成熟結(jié)果

在卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液中添加HMG（FSH∶LH≈1∶1）可替代FSH和LH激素的添加，不同HMG濃度也可促進(jìn)COCs的擴(kuò)散（圖3），在培養(yǎng)22h后卵丘細(xì)胞擴(kuò)散直徑表現(xiàn)為對(duì)照組（圖3A）＜OM Ⅳ（圖3B）＜OM Ⅴ（圖3C）＜OM Ⅵ（圖3D）＜OMⅦ（圖3E）。隨著激素濃度增加擴(kuò)散直徑也在增加，但當(dāng)濃度大于0.2IU／mL濃度時(shí)擴(kuò)散度不再增加。同樣運(yùn)用ImageJ2x軟件測(cè)定各組成熟液中的卵母細(xì)胞擴(kuò)增距離顯示，不加激素的對(duì)照組與添加激素的OM Ⅳ、OM Ⅴ、OM Ⅵ、OMⅦ各組中卵母細(xì)胞的擴(kuò)增距離差異顯著（P＜0.05）。添加激素的各組之間差異不顯著（P＞0.05）。如圖4顯示（擴(kuò)散直徑對(duì)應(yīng)圖3次序）。

表1 不同F(xiàn)SH和LH濃度對(duì)灘羊卵母細(xì)胞體外成熟的影響Table1 The effects of FSH and LH concentration on in vitro maturation of tan sheep oocytes

在成熟培養(yǎng)液中添加不同濃度的HMG，卵母細(xì)胞的成熟率不同（表2）。其中添加0.1IU／mL HMG的成熟液的成熟率為69.6%，與對(duì)照組差異顯著（P＜0.05）。這表明0.1IU／mL HMG添加培養(yǎng)液中有利于卵母細(xì)胞的成熟。

圖3 HMG對(duì)卵丘－卵母細(xì)胞復(fù)合體（COCs）擴(kuò)散的影響（40×）Fig.3 The effects of HMG on Tan sheep oocyte maturation in vitro（40×）

圖4 不同HMG激素濃度卵母細(xì)胞的擴(kuò)散距離（擴(kuò)散直徑對(duì)應(yīng)圖3次序）Fig.4 The oocyte diffusion distance in different HMG hormone concentrations（Diffusion diameter corresponding figure 3order）

表2 HMG濃度對(duì)灘羊卵母細(xì)胞體外成熟的影響Table2 The effects of HMG concentration on in vitro maturation of Tan sheep oocytes

3 討論

哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)技術(shù)是利用類固醇激素和促性腺激素在體外模擬卵泡的環(huán)境，進(jìn)而誘發(fā)卵母細(xì)胞成熟的一項(xiàng)試驗(yàn)研究。在卵母細(xì)胞成熟過程中，促卵泡素FSH和出黃體素LH等促性腺激素素具有協(xié)同作用，共同調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞成熟。研究表明，F(xiàn)SH能顯著提高體外成熟卵母細(xì)胞的體外受精能力及早期胚胎的發(fā)育能力，其中FSH與誘導(dǎo)卵丘擴(kuò)散、暫時(shí)抑制GVBD，改變了第一次減數(shù)分裂所需的時(shí)間，從而促進(jìn)了卵母細(xì)胞的成熟。LH也有類似作用，另一方面通過除去成熟分裂抑制因子而對(duì)卵母細(xì)胞發(fā)揮作用[6]。

FSH在卵泡發(fā)育中起至關(guān)重要的作用，它通過cAMP途徑促進(jìn)卵丘細(xì)胞增生并產(chǎn)生相應(yīng)的LH受體[7]促使卵丘細(xì)胞膨散，通過刺激顆粒細(xì)胞分泌成熟促進(jìn)物，直接或間接地作用于卵母細(xì)胞，啟動(dòng)卵母細(xì)胞成熟分裂[8]，將FSH加入培養(yǎng)基中促進(jìn)人卵母細(xì)胞體外成熟，獲81%的成熟率[9]。對(duì)于LH，一般認(rèn)為通過兩條途徑發(fā)揮作用：一是引起卵丘發(fā)生變化，促進(jìn)卵丘細(xì)胞擴(kuò)散，可以促進(jìn)顆粒細(xì)胞上孕酮受體的表達(dá)及孕酮的產(chǎn)生，孕酮通過Connexin 43導(dǎo)致GVBD便于精子通過卵丘細(xì)胞間隙到達(dá)透明帶[10]；二是顯著增強(qiáng)了卵母細(xì)胞的存活力，降低異常卵母細(xì)胞的數(shù)量，從而提高卵母細(xì)胞的受精率[11]。

即使同一種動(dòng)物，在卵母細(xì)胞體外成熟中，所添加FSH和LH劑量的報(bào)道也不盡相同。如在綿羊，Obrien J K 等[12]添加 FSH／LH 的量為10μg／mL，Andrew等的添加量為5μg／mL，Daniel等的添加量為L(zhǎng)H 10μg／mL，F(xiàn)SH 1μg／mL。本試驗(yàn)結(jié)果表明在成熟液中添加激素FSH和LH可以獲得不同的卵母細(xì)胞成熟率（68.8%～54.6%），在 FSH／LH 小于200μg／40μg／mL，隨著激素濃度增加成熟率呈濃度正相關(guān)。但當(dāng)激素濃度大于300μg／60μg／mL，表現(xiàn)出對(duì)卵母細(xì)胞成熟的抑制作用。同樣，添加HMG單位濃度在小于0.1IU／mL時(shí)，卵母細(xì)胞的成熟率表現(xiàn)為正相關(guān)，但當(dāng)其濃度大于0.1IU／mL下，卵母細(xì)胞的成熟表現(xiàn)為抑制作用，這與敖紅等[13]在綿羊上的研究結(jié)果相似。HMG含有1∶1（U）的FSH和LH，可用來代替FSH和LH用于山羊和牛卵母細(xì)胞的成熟培養(yǎng)[14]。本研究比較了FSH和LH配合使用或HMG單獨(dú)使用時(shí)對(duì)灘羊卵母細(xì)胞體外成熟的影響。結(jié)果表明，200μg／mL FSH和40μg／mL LH配合使用對(duì)卵母細(xì)胞的成熟的效果稍差于0.1IU／mL HMG添加效果，這與賽務(wù)家甫的研究結(jié)果略有不同[15]，推斷差異可能是由于激素的不同生產(chǎn)廠家造成的。

綜上所述，在卵母細(xì)胞體外成熟中，添加200μg／mL FSH和40μg／mL LH與或添加0.1IU／mL HMG的成熟培養(yǎng)體系在灘羊卵母細(xì)胞體外成熟中效果良好，為進(jìn)一步進(jìn)行灘羊卵母細(xì)胞的應(yīng)用試驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。

[1]孫曉萍，郎 俠，楊博輝，等.提高灘羊繁殖性能的幾種方法[J].畜牧與飼料科學(xué)，2010，31（3）：91－92.

[2]Edwards R G.Maturation in vitro of mouse，sheep，cow，pig，rhesus，monkey and human ovarian oocytes[J].Nature，1965，208：349－351.

[3]武 浩.小鼠，山羊交互異種核移植研究[D].陜西楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2004.

[4]石德順，盧克煥.牛卵泡液對(duì)牛卵母細(xì)胞體外成熟的影響[J].廣西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1994（13）：1－5.

[5]徐建祥，周木清，陳小武，等.不同條件對(duì)牛卵母細(xì)胞體外成熟的影響[J].黑龍江動(dòng)物繁殖，1996，4（2）：13－14.

[6]Iwata H，Akamatsu S，Minami N，et al.Allopueinol，an inhibitor of xanthine oxidase improves the development of IVM／IVF bovine embryos（＞4cell）in vitro under certain culture econditions[J].Theirogenology，1999，51：613－622.

[7]侯文慶.卵泡發(fā)育的激素調(diào)節(jié)研究進(jìn)展[J].上海獸醫(yī)畜牧通訊，2001（2）：67－69.

[8]Zhang L，Jing S W，Ozniak P J，et al.Cumulus cell function during bovine oocyte maturation，fertilization and embryo development in vitro[J].Mol Reprod Develop，1995，40：338－341.

[9]謝常青，林 戈，楊蘇安，等.人類不成熟卵母細(xì)胞體外成熟影響的因素初探[J].生殖與避孕，2000，20（3）：6－7.

[10]Masayuki S，Takat O T.FSH and LH induce progesterone production and progesterone recept or synthesis in cumulus cells：are quirement for meiotic resumption in porcine oocytes[J].Mol Human Reprod，2002，8（7）：612－618.

[11]Roberts R，Iatropoulou A，Ciantar D，et al.Follicle－stimulat－ing hormone affects metaphase I chromosome alignment and increases aneuploidy in mouse oocytes matured in vitro[J].Biol Reprod，2005，72（9）：107－118.

[12]O＇Brien J K，Catt S L，Ireland K A，et al.In vitro and in vivo developmental capacity of oocytes from prepubertal and adult sheep[J].Theriogenology，1997，47：1433－1443.

[13]敖 紅，孫桂金，尹遜河，等.綿羊卵母細(xì)胞體外成熟的研究[J].中國(guó)草食動(dòng)物，2006，25（6）：14－16.

[14]李雪峰.牛卵母細(xì)胞孤雌激活與體細(xì)胞核移植[D].陜西楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2001.

[15]賽務(wù)家甫.提高綿羊體細(xì)胞核移植效率的研究[D].陜西楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2007.