曹 藍(lán)，焦培榮＊，宋亞芬，龔 浪，袁潤余，韋良孟，亓文寶，廖 明＊

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510642；2.人獸共患病防控制劑國家地方聯(lián)合工程實驗室、農(nóng)業(yè)部獸用疫苗創(chuàng)制重點實驗室、廣東省動物源性人獸共患病預(yù)防與控制重點實驗室，廣東 廣州 510642）

禽流感（Avian influenza，AI）是由正黏病毒科A型流感病毒屬禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）引起的禽類傳染病。該病廣泛流行于世界上多個國家和地區(qū)，給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。根據(jù)AIV的表面蛋白HA和NA抗原性，可將AIV分為16個HA亞型和9個NA亞型[1]。目前我國常見的AIV主要有H1、H3、H5、H6、H9和H10亞型[2－3]，其中 H5N1、H9N2和 H6N2是主要流行的禽流感病毒亞型。目前只有H5和H7亞型的部分毒株為高致病性禽流感病毒，其余亞型均為低致病性禽流感病毒。

水禽是流感病毒的自然宿主和基因儲存庫，已知全部AIV亞型幾乎均可以從水禽分離到[4]，說明水禽在影響流感病毒的進(jìn)化和生態(tài)分布中發(fā)揮重要作用。H3亞型流感病毒宿主范圍廣泛，包括人、禽、豬、犬、馬、貓等[5－6]。2003年，美國首次從犬分離到了H3N8亞型犬流感病毒，遺傳進(jìn)化分析顯示，其來源于H3N8亞型的馬流感病毒[7]；2006年，韓國首次分離到H3N2亞型犬流感病毒，遺傳進(jìn)化分析顯示，其來源于 H3N2亞型的AIV[8－9]。據(jù)此可知 H3亞型流感病毒具有較強(qiáng)的宿主適應(yīng)性，這為其跨宿主傳播提供了可能。近年來，我國在不同地區(qū)和宿主中多次分離到 H3亞型 AIV[10－11]。因此，有必要加強(qiáng)對H3亞型AIV的流行病學(xué)調(diào)查，以便為我國AIV的防控提供基本數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒與雞胚 鴨源 H3N6亞型AIV A／Duck／Guangdong／E9／2012（H3N6）是本課題組在廣東地區(qū)進(jìn)行禽流感流行病學(xué)調(diào)查時，在一份青頭鴨泄殖腔拭子中分離到的AIV，現(xiàn)由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部獸藥創(chuàng)制重點實驗室保存。9日齡～10日齡SPF雞胚購自北京梅里亞維通實驗動物技術(shù)有限公司。

1.1.2 菌種和主要試劑 克隆載體pMD18－T購自TaKaRa公司；大腸埃希菌JM109感受態(tài)細(xì)胞由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部獸藥創(chuàng)制重點實驗室保存；TRIAZOL試劑購自美國Invitroge公司；反轉(zhuǎn)錄酶、EX Taq酶購自TaKaRa公司；凝膠純化回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自天根生化科技有限公司。

1.1.3 引物設(shè)計與合成 參考GenBank收錄的H3N6亞型AIV基因序列，應(yīng)用DNA Star 7.1及Oligo 6.0軟件，在相對保守區(qū)分別設(shè)計擴(kuò)增8個基因片段的引物[12]。引物由上海英駿生物工程公司合成。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取和RT－PCR 按病毒RNA提取試劑盒Trizol說明書提取病毒總RNA，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，將獲取的cDNA為模板按常規(guī)方法進(jìn)行PCR。

1.2.2 基因的克隆和鑒定 PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收后，與pMD18－T連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)菌液PCR進(jìn)行初步鑒定，對陽性菌液進(jìn)行重組質(zhì)粒的抽提，所抽提的質(zhì)粒由深圳華大基因公司測序。

1.2.3 系統(tǒng)進(jìn)化分析 用DNA Star 7.1中的Seq－Man軟件拼接所得各個基因的序列以獲得全基因的序列，將所測得的各基因片段的序列在GenBank中進(jìn)行Blast分析。

采用MEGA 4.0軟件，以基因ORF為基本單元，繪制其全基因組的系統(tǒng)進(jìn)化樹。繪制方法為Neighbor－joining法（參數(shù)設(shè)置為1000replications）及Maximum composite likelihood model比對核苷酸序列。

2 結(jié)果

2.1 病毒全基因組序列同源性分析

將該毒株已測序的 HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M、NS 8個基因的序列經(jīng)DNA Star軟件包的Seqman軟件拼接后，輸入GenBank進(jìn)行Blast比較。GenBank中與E9毒株8個基因核苷酸序列相似性最高的毒株，結(jié)果見表1。

表1 E9毒株各基因片段與GenBank中相似性最高的毒株Table1 The AIV strains in GenBank with highest nucleotide similarity with E9when analyzing each gene fragment

2.2 病毒全基因組的分子特征

E9毒株HA基因序列分析表明，HA基因編碼區(qū)由1701個核苷酸組成，共編碼567個氨基酸，不存在氨基酸缺失。根據(jù)其核苷酸序列推導(dǎo)出其氨基酸序列，分析顯示HA裂解位點附近的氨基酸序列為PEKQTR↓GLF，只含有一個堿性氨基酸，符合低致病性禽流感裂解位點的氨基酸序列特征。在HA肽鏈上存在6個潛在N－糖基化位點，分別位于氨基酸殘基的24－NST、38－NGT、54－NAT、181－NVT、301－NGS和499－NGT位，與代表毒株相比沒有出現(xiàn)新的糖基化位點的變異。受體結(jié)合位點分析顯示，135位為禽源G，137位為禽源N，226、227和228位受體結(jié)合位點為谷氨酰胺（QSG），均為禽源毒株分子特征，沒有出現(xiàn)哺乳動物流感病毒特有HA受體結(jié)合位點的氨基酸變異。

NA基因編碼區(qū)由1413個核苷酸組成，共編碼471個氨基酸，頸部不存在氨基酸缺失。在NA肽鏈上存在9個潛在N－糖基化位點，分別位于氨基酸殘基的51－NET、54－NST、62－NNT、67－NFT、70－NIT、85－NLT、146－NGT、201－NAS和402－NNS位，神經(jīng)氨酸酶可能的耐藥性位點的氨基酸為E119、R152、H274、R292和N294均沒有發(fā)生變異。

內(nèi)部基因序列分析表明，PB2蛋白627位為E、701位為D，未出現(xiàn)突變。M2蛋白26位、27位、30位和31位相對保守，未出現(xiàn)金剛烷胺耐藥特點。NS基因由890個核苷酸組成，NS1由693個核苷酸組成，共編碼231個氨基酸，其42位、92位和103位較為保守，在106位和149位出現(xiàn)I→M和V→A的突變。

2.3 病毒全基因組的遺傳進(jìn)化分析

E9的HA基因與GenBank中相應(yīng)流感病毒HA基因序列繪制的分子遺傳進(jìn)化樹如圖1所示，歐亞譜系的H3亞型流感病毒劃分為3個分支，分別以A／Turkey／England／1969（H3N2）為代表株的禽源分支、以 A／Hong Kong／1／1968（H3N2）為代表株的豬源／人源分支及以 A／Canine／Texas／1／2004（H3N8）為代表株的犬源／馬源分支。E9毒株的HA基因?qū)儆跉W亞譜系禽源分支，其與A／Duck／Mongolia／OIE－7457／2011（H3N5）的分子遺傳關(guān)系最近，處于同一分支。

根據(jù)GenBank中H＊N6亞型流感病毒的參考序列，將NA基因的分子遺傳進(jìn)化樹劃分為4部分，分別以 A／Duck／Hong Kong／231／1977（H3N6）為代表株的歐亞分支、以A／Duck／England／1956（H11N6）為代表株的歐亞／美洲分支、以A／Duck／New Zealand／31／1976（H4N6）為代表株的大洋洲分支和以 A／Ruddy tumstone／NJ／47／1985（H4N6）為代表株的美洲分支。如圖2所示，E9毒株的NA基因?qū)儆跉W亞分支，其與A／Common pochard／Aktau／1455／2006（H4N6）及 A／Mallard／Altai／1208／2007（H3N6）的分子遺傳關(guān)系最近。

圖1 E9毒株HA基因遺傳進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic analysis of HA gene of E9strain

圖2 E9毒株NA基因遺傳進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic analysis of NA gene of E9strain

其E9的 PB2、PB1、PA、NP、M 和 NS基因的分子遺傳進(jìn)化樹如圖3～圖8所示，它們均屬于以A／Duck／Hong Kong／7／1975（H3N2）為代表株的歐亞譜系禽源分支。

綜上所述表明，A／Duck／Guangdong／E9／2012（H3N6）毒株的全基因組序列均屬于歐亞譜系的禽源進(jìn)化分支，尚未發(fā)生不同宿主的基因重組。

圖3 E9毒株P(guān)B2基因進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic analysis of PB2gene of E9strain

圖4 E9毒株P(guān)B1基因遺傳進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic analysis of PB1gene of E9strain

圖5 E9毒株P(guān)A基因遺傳進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic analysis of PA gene of E9strain

圖6 E9毒株NP基因遺傳進(jìn)化樹Fig.6 Phylogenetic analysis of NP gene of E9strain

圖7 E9毒株M基因進(jìn)化樹Fig.7 Phylogenetic analysis of M gene of E9strain

圖8 E9毒株NS基因遺傳進(jìn)化樹Fig.8 Phylogenetic analysis of NS gene of E9strain

3 討論

本研究毒株A／Duck／Guangdong／E9／2012（H3N6）進(jìn)行序列分析表明，HA基因與2011年分離于蒙古國的 AIV A／Duck／Mongolia／OIE－7457／2011（H3N5）同源性最高，NA基因與分離于蒙古國的AIV A／Duck／Mongolia／OIE－7438／2011（H4N6）同源性最高。目前全球范圍主要有8條候鳥遷移路線，其中有3條遷移路線經(jīng)過我國，而且2005年我國學(xué)者在青海湖分離到的高致病性禽流感病毒經(jīng)證實是由候鳥帶入我國國內(nèi)的[13]，因此推測，E9毒株的HA及NA基因也可能是由候鳥遷徙經(jīng)境外帶入我國。該病毒可能由近年國外的H3亞型AIV與H4N6亞型AIV重組而來。

遺傳進(jìn)化結(jié)果顯示，E9毒株尚未出現(xiàn)不同宿主來源的基因重組現(xiàn)象，仍屬于歐亞譜系的禽源分支。但由于H3亞型流感病毒的宿主廣泛，如H3N2和H3N8亞型流感病毒會發(fā)生不同宿主間基因重組的現(xiàn)象[14]。因此，仍需對H3N6亞型AIV進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，以期為其基因重組情況的監(jiān)測提供研究依據(jù)。

H3亞型流感病毒為低致病性病毒，其流行十分廣泛。但H3N6亞型AIV在我國的報道并不多見。GenBank中僅有2000年－2001年在江西省從雞、鴨、鴿子和鵪鶉中分離到過H3N6亞型AIV，自此便少有報道。我們將E9毒株與江西分離株A／Chicken／Nanchang／7－010／2000（H3N6）進(jìn)行基因序列比較分析，結(jié)果顯示，雖然在HA蛋白裂解位點和表面糖基化位點上兩毒株無顯著差異，但二者HA基因的核苷酸同源性為96.7%、NA基因的核苷酸同源性僅為92%，說明在我國H3N6亞型AIV出現(xiàn)了一定程度的變異，但還尚未引起廣泛流行。

綜上所述，我國廣東地區(qū)現(xiàn)已分離到H3N6亞型AIV，該病毒從分子特征角度分析仍為低致病性禽流感病毒，并且可能經(jīng)與不同亞型AIV基因重組而來，盡管尚未出現(xiàn)不同宿主來源流感病毒的基因重組，由于流感病毒為RNA病毒、其基因組分節(jié)段的特點使其在流行傳播的過程中容易發(fā)生抗原漂移、抗原轉(zhuǎn)換和基因重排，進(jìn)而可能出現(xiàn)快速的變異。許多研究表明，低致病性禽流感可以通過基因重排為人流感病毒提供基因來源或為高致病性禽流感病毒提供基因片段，間接的導(dǎo)致AIV的流行[15]。因此，在加強(qiáng)對高致病性禽流感監(jiān)測和研究的同時，也必須要對低致病性禽流感的遺傳進(jìn)化情況給予足夠重視。

A／Duck／Guangdong／E9／2012（H3N6）毒株為我國廣東地區(qū)首次分離報道的H3N6亞型AIV。因此，本研究對其全基因序列進(jìn)行測定并進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，以期為我國AIV流行病學(xué)研究及禽流感防控提供一定基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

[1]Fouchier R A，Munster V，Wallensten A，et al.Characterizationof a novel influenza A virus hemagglutinin subtype（H16）obtained from black－h(huán)eaded gulls[J].J Virol，2005，79（5）：2814－2822.

[2]Pepin K M，Wang J，Webb C T，et al.Multiannual patterns of influenza A transmission in Chinese live bird market systems[J].Influenza Other Respi Viruses，2013，7（1）：97－107.

[3]Pei R J，Lan C，Run Y Y，et al.Complete genome sequence of an H10N8avian influenza virus isolated from a live bird market in southern China[J].J Virol，2012，86（14）：7716

[4]Webster R G，Bean W J，Gorman O T，et al.Evolution and ecology of influenza A viruses[J].Microbiol Rev，1992，56（1）：152－179.

[5]王建琪，華育平，曾祥偉，等.禽流感病毒H3N8亞型野鴨源分離株基因特征[J].東北林大學(xué)學(xué)報，2011，39（3）：92－95.

[6]Song D S，An D J，Moon H J，et al.Interspecies transmission of the canine influenza H3N2virus to domestic cats in South Korea，2010 [J].J Gen Virol，2011，92（10）：2350－2355.

[7]Jirjis F F，Deshpande M S，Tubbs A L，et al.Transmission of canine influenza virus（H3N8）among susceptible dogs[J].Vet Microbiol，2010，144（3／4）：303－309.

[8]Daesub S，Bokyu K，Chulseung L，et al.Transmission of avian influenza virus（H3N2）to dogs[J].Emerg Infect Dis，2008，14（5）：741－746.

[9]Li S，Shi Z，Jiao P，et al.Avian－origin H3N2canine influenza A viruses in Southern China[J].Infect Genet Evol，2010，10（8）：1286－1288.

[10]Juan P，Qin F L，Ying J X，et al.Genetic analysis of H3subtype influenza viruses isolated from domestic ducks in northern China during 2004－2005[J].Virus Genes，2009，38：136－142.

[11]屈素潔，鄭 敏，梁 媛，等.2株H3N8亞型禽流感病毒HA和NA基因遺傳變異分析[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2011，32（9）：41－45.

[12]Hoffmann E，Stech J，Guan Y，et al.Universal primer set for the full－length amplification of all influenza A viruses[J].Arch Virol，2001，146（12）：2275－2289.

[13]Liu J H，Xiao H，Lei F，et al.Highly pathogenic H5N1influenza virus infection in migratory birds[J].Science，2005，309：1206.

[14]姚 艷，張桂紅，劉文軍，等.一株H3N2亞型豬流感病毒廣東分離株的基因組序列分析[J].微生物學(xué)報，2007，47（5）：805－809.

[15]Alexander D J.A review of avian influenza in different bird species[J].Vet Microbiol，2000，74：3－13.