翁啟芳

(海南醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，海南 ?？?571199)

新生大鼠大腦皮層神經(jīng)元的原代培養(yǎng)

翁啟芳

(海南醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，海南 ?？?571199)

目的 成功建立簡便易行的原代神經(jīng)元培養(yǎng)模型的方法。方法 無菌操作條件下，培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板經(jīng)L-多聚賴氨酸包被過夜，用15%完全培養(yǎng)液混懸神經(jīng)元，以細胞密度為5×104細胞/mL的濃度種植，24h后倒置相差顯微鏡觀察神經(jīng)元貼壁后即用阿糖胞苷(10μmol/L)以抑制神經(jīng)膠質(zhì)細胞及非神經(jīng)細胞的增殖，每48h進行每皿或每孔半量換液。結(jié)果 神經(jīng)元貼壁生長較多，神經(jīng)膠質(zhì)或成纖維細胞被抑制，在半量換液中可清除，獲得相對單純的神經(jīng)元。結(jié)論 簡便易行的原代皮層神經(jīng)元培養(yǎng)方法，可以得到相對單純體外培養(yǎng)的神經(jīng)元模型。

皮層神經(jīng)元；原代培養(yǎng)；細胞模型

從新生動物或動物胚胎（如大鼠或小鼠）的腦組織取出局部區(qū)域的腦細胞，制成單細胞種植在培養(yǎng)容器后不再移植的過程，常稱為原代神經(jīng)元培養(yǎng)[1]。新生動物皮層神經(jīng)元是一種高度分化的細胞[2]，且神經(jīng)元體外離散分離培養(yǎng)所需要的營養(yǎng)條件相比較其他組織細胞培養(yǎng)較為困難。原代皮層神經(jīng)元培養(yǎng)模型的成功建立，是近代神經(jīng)科學(xué)研究中最重要的基礎(chǔ)方法之一。本文主要介紹簡便易行的新生大鼠皮層神經(jīng)元原代培養(yǎng)的流程。

1 實驗用品的配置

1.1 基本的器械設(shè)備

無菌操作室、操作凈化臺、CO2培養(yǎng)箱、倒置相差顯微鏡、冰箱、水純化系統(tǒng)、高壓消毒鍋；外科剪、細鑷子、移液管、吸管、燒杯、離心管、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)板。

1.2 主要的培養(yǎng)基質(zhì)

有常用分子量為140，000的0.1mg/mL L-多聚賴氨酸、D - Hank’s 液，高糖培養(yǎng)液（干粉DMEM配置），10%胎牛血清或馬血清[3]、0.125%胰蛋白酶溶液。

2 神經(jīng)元培養(yǎng)

2.1 培養(yǎng)板準(zhǔn)備

一般在細胞培養(yǎng)前1d，將使用的培養(yǎng)皿（35mm）或培養(yǎng)板涂上一層(濃度0.1mg/mL)L-多聚賴氨酸過夜，置于超凈臺中備用。

2.2 取材

根據(jù)實驗?zāi)康倪x取新生大鼠（1～3d）的大腦組織。

2.3 培養(yǎng)步驟

①胰酶消化：新生的Wistar大鼠無菌斷頭取出全部大腦皮層組織，在4℃的D-Hank’s液（pH7.0）中用外科剪剪碎皮層組織制成細胞懸液；0.125%胰蛋白酶37℃水浴箱預(yù)熱5min，然后加入無菌玻璃試管收集的細胞懸液內(nèi)消化5min，并以15%完全培養(yǎng)液（胎牛血清15mL+DMEM培養(yǎng)液配置85mL）終止胰酶消化。②細胞計數(shù)：細胞懸液預(yù)先經(jīng)100～200目尼龍網(wǎng)過濾后收集至50mL離心管中以1000g× 6min離心，棄去離心后的上清液，用15%完全培養(yǎng)液混懸離心后沉淀的細胞并進行細胞計數(shù)測定。③接種：以細胞密度為5×104細胞/mL的濃度，接種種植于預(yù)先用L-多聚賴氨酸包被過的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板，并置于37℃下5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育。④獲取單純神經(jīng)元：放置培養(yǎng)箱中的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板中的神經(jīng)元經(jīng)過24h后即可穩(wěn)定的貼壁生長，24h后在每孔板內(nèi)加入阿糖胞苷(10μmol/L)可以及時抑制神經(jīng)膠質(zhì)細胞的快速生長，從而獲得相對單純的原代皮層神經(jīng)元（圖1）。

3 神經(jīng)元識別

通過顯微鏡下觀察細胞外形進行細胞的識別[4]。培養(yǎng)器中的神經(jīng)元以貼壁方式進行生長，無懸浮感，細胞體呈圓形或梭形，有明顯的核仁，突起明顯，立體感強，常見細胞膜外有光“暈”（圖2）。培養(yǎng)細胞中成纖維細胞或膠質(zhì)細胞，如“地毯”似貼壁（圖3，紅色箭頭），神經(jīng)元貼壁較慢，落在“地毯”上生長遷移和分化。所以在種植24h后觀察培養(yǎng)的神經(jīng)元存活較多后即可加入阿糖胞苷以抑制神經(jīng)膠質(zhì)細胞的快速生長，從而獲得較單純的神經(jīng)元。神經(jīng)元的體外培養(yǎng)時間不宜過長，如用15%胎牛血清+85%DMEM培養(yǎng)液種植的神經(jīng)元生長最適宜時間在10d內(nèi)。若種植神經(jīng)元密度過多(圖4)，也將導(dǎo)致神經(jīng)元分解代謝的物質(zhì)會影響正常神經(jīng)元的生長并加速神經(jīng)元的死亡，如神經(jīng)元突起縮回呈橢圓懸浮狀或細胞胞漿裂解勻質(zhì)小塊狀（圖5）。

4 小 結(jié)

1956年Nakai首創(chuàng)了神經(jīng)組織的分離細胞培養(yǎng)方法[5]。神經(jīng)元的體外培養(yǎng)模型于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和神經(jīng)科學(xué)中已被廣泛應(yīng)用，例如腦缺氧和缺血損傷、阿爾之海默病及興奮性神經(jīng)毒等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究。成功建立體外原代皮層神經(jīng)元培養(yǎng)的模型，可進一步作為藥物作用神經(jīng)元靶點及藥物結(jié)合特異性受體功能作用的研究，是探討多種神經(jīng)元損傷致病機理及治療手段最好的研究方法之一。

[1] 張卓然.培養(yǎng)細胞學(xué)與細胞培養(yǎng)技術(shù)[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,2004:467-468.

圖1 種植神經(jīng)元24h (10×40)

圖2 種植神經(jīng)元第8d (10×40)

圖3 種植神經(jīng)元第8d (10×40)

圖4 種植神經(jīng)元第8d (密度過多，10×40)

圖5 種植神經(jīng)元＞10d (10×40）

[2] 《中國組織工程研究與臨床康復(fù)》雜志社學(xué)術(shù)部.組織工程研究中神經(jīng)細胞的培養(yǎng)[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù),2011, 15(50):9466-9467.

[3] 于麗華,趙書平,席先成,等.不同種類血清對新生大鼠大腦皮層神經(jīng)細胞培養(yǎng)的影響[J].實用醫(yī)藥雜志,2002,19(3):53-56.

[4] 李玉,但齊琴,習(xí)楊彥彬.成年小鼠海馬神經(jīng)細胞培養(yǎng)及其鑒定[J].昆明醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2011,32(6):29-32.

[5] 于樣,金英.神經(jīng)細胞培養(yǎng)方法在缺血性腦損傷研究中的應(yīng)用[J].錦州醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2003,24(1):53-56.

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1671-8194（2013）20-0087-02