姚觀平，余麗梅，楊平花，王雨波

(1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院貴州省細(xì)胞工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州遵義 563099;2.遵義醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院 心電圖室，貴州 遵義 563002)

精制胃樂膠囊(refine Wei Le capsule，rWLC)由白芍、蒼術(shù)、元胡、肉桂等六味中藥精制而成。處方源于貴州省黔東南地區(qū)，具有溫中和胃、降逆止嘔、解痙之功效，民間用于氣滯所致胃脘疼痛，腹脹納差，反酸噯氣等癥。原方劑又名胃樂散，以往的研究表明該方劑對多種實(shí)驗(yàn)性消化性潰瘍具有良好治療作用［1］，對胃腸運(yùn)動也有調(diào)節(jié)作用。為提高質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和減少用藥量，在原制備工藝基礎(chǔ)上，通過3種新制劑對大鼠急性胃潰瘍治療效果篩選后，發(fā)現(xiàn)rWLC的療效優(yōu)于水提、醇提工藝制備的新制劑。進(jìn)而本研究主要就rWLC的抗炎鎮(zhèn)痛作用和急性毒性進(jìn)行了檢測和評價，為rWLC的進(jìn)一步研發(fā)提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 清潔級昆明種小鼠，雌雄各半，體重18～22 g，SPF級，購于重慶市中藥研究院實(shí)驗(yàn)動物研究室，許可證號:SCXK(渝)20070006;SD大鼠50只，體重180～220 g，雌雄各半，由第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，清潔級(Ⅱ級)，合格證號:SCXK(遼)2007－0005。

1.1.2 藥物 rWLC按胃樂散中藥成分配方，由遵義醫(yī)學(xué)院與貴陽春科藥物研發(fā)股份有限公司聯(lián)合精制而成。實(shí)驗(yàn)前將其用研缽磨成細(xì)粉，再用蒸餾水配制成20%、15%和7.5%的混懸液，4℃冰箱貯存，備用;哌替啶:宜昌人福藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號2008.12.02。地塞米松磷酸鈉注射液:貴州光正藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號:2009.04.23。

1.2 方法

1.2.1 扭體鎮(zhèn)痛試驗(yàn)［2－3］將健康昆明種小鼠隨機(jī)分為5組，每組8只，分別為:空白對照組(等量生理鹽水)，陽性對照組(哌替啶0.02 g/kg)，rWLC 高、中、低劑量組(0.30，0.15，0.075 g/kg)1次灌胃給藥40 min后，腹腔注射0.6%醋酸(Acetic acid glacial，HAC)，0.1 mL/10g，記錄 15 min 內(nèi)小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)，計(jì)算疼痛抑制率。

疼痛抑制率(%)=(模型組扭體次數(shù)一給藥組扭體次數(shù))/模型組扭體次數(shù)×100%。

1.2.2 足趾腫脹抗炎試驗(yàn)［4］SD大鼠 50只，rWLC試藥組每天1次，連續(xù)灌胃給藥3 d，地塞米松組(0.5%地塞米松磷酸鈉注射液5 mg/kg(0.5%溶液1 mL/kg)單次腹腔注射給藥。將大鼠右后肢拉直，用軟塑料尺分別量取足跖或踝關(guān)節(jié)的周長，連測兩次，其平均值為用藥前的周長。末次給藥40 min后在每鼠右后肢足掌遠(yuǎn)端進(jìn)針至踝關(guān)節(jié)附近，皮下注射10%蛋清溶液0.1 mL。之后于0.5 h、1.0 h、1.5 h 和 2 h 分別測量大鼠足跖或踝關(guān)節(jié)的周長。按下式計(jì)算各藥在不同時間內(nèi)的足腫脹度:

1.2.3 急性毒性實(shí)驗(yàn)［5－6］預(yù)實(shí)驗(yàn)未測出半數(shù)致死量(median lethal dose，LD50)后，取昆明種小鼠80只，雌雄各半，隨機(jī)分為rWLC高、中、低劑量組和空白組，每組20只，以最大給藥體積0.4 mL/10g，分別灌胃給予7.5%、15%、20%rWLC 和等體積飲用水，24 h內(nèi)給藥3次，連續(xù)觀察14 d，記錄小鼠活動、精神狀態(tài)、毛色光澤、體重、攝食量、大小便、口腔分泌物以及存活情況。按公式計(jì)算最大給藥量［6］，最大給藥量(g/kg)=每天給藥次數(shù)(次/d)×最大給藥體積(mL/20g)×最大給藥濃度(g/mL)×50(kg)。相當(dāng)于擬推薦臨床劑量的倍數(shù)=最大給藥量÷［成人臨床擬推薦最大給藥劑量(g/kg/d)×60 kg］。第15天，處死小鼠，觀察小鼠主要臟器病理組織學(xué)變化情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示，組間比較采用方差分析，P＜0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 rWLC對蛋清所致大鼠足趾炎癥的影響 與模型組比較，不同時間點(diǎn)(0～3 h)，rWLC低、中、高劑量組大鼠足周長明顯降低(P＜0.01)，且隨rWLC劑量的增加以及其作用時間的延長，大鼠足周長明顯、逐漸地減小。rWLC低劑量組在蛋清注射0.5 h時對足周長沒有明顯影響;rWLC各劑量組大鼠的足周長與地塞米松組比較無顯著差異(P﹥0.05，見表1)。

表1 rWLC對蛋清致大鼠足趾腫脹的影響(x ± s，n=10)

2.2 rWLC的鎮(zhèn)痛作用 空白組小鼠在觀察時間內(nèi)未出現(xiàn)扭體反應(yīng)，而模型組出現(xiàn)了明顯的扭體反應(yīng)，且頻率較高。與模型組比較，rWLC低、中、高劑量單次灌胃給藥40 min后，均能顯著降低醋酸誘導(dǎo)的小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)，疼痛抑制率分別為34.31%、43.51% 和 62.34%;與哌替啶組比較，rWLC組小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)相對較高(見圖1)，疼痛抑制率約為哌替啶的4/10～7/10，哌替啶的疼痛抑制率高達(dá)88.91%。

圖1 rWLC對醋酸所致小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)的影響

2.3 rWLC的急性毒性

2.3.1 rWLC的LD50與小鼠一般狀況 在預(yù)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上探索給藥劑量范圍，1次給藥8 g/kg后，觀察14 d，小鼠活動自如，皮毛整潔、有光澤，鼻、眼、口腔未見異常分泌物，呼吸平穩(wěn)，進(jìn)食正常，大小便未見異常，小鼠全部存活，未見死亡，未測出rWLC的LD50，表明rWLC對小鼠的急性毒性反應(yīng)不明顯，需進(jìn)一步進(jìn)行最大給藥量測定。

2.3.2 rWLC的最大給藥量 1 d內(nèi)給藥3次，給予24 g/kg rWLC后，連續(xù)觀察14 d，小鼠沒有出現(xiàn)明顯的毒性反應(yīng)和死亡，給藥組及對照組小鼠的精神、進(jìn)食、分泌物、排泄物等一般狀況未見異常變化，且rWLC各組小鼠體重均隨時間延長逐漸增加(見表2)，不同時間點(diǎn)rWLC各劑量組雌性和雄性小鼠與空白組相應(yīng)組相應(yīng)性別小鼠體重比較均無顯著差異(P ＞0.05)。

2.3.3 rWLC對小鼠重要臟器組織病理學(xué)的影響第15天處死小鼠，解剖、肉眼觀察心、肝、脾、肺、腎、大腸、小腸、胃、膀胱及腦等主要臟器外形、大小、質(zhì)地正常，切面也均未見異常變化，顯微鏡下觀察HE染色后的心、肝、脾、肺、腎組織切片也未見明顯的組織形態(tài)改變(見圖2)。

表2 rWLC對小鼠體重的影響(x ± s，n=10)

圖2 rWLC對小鼠心、肝、脾、肺、腎組織組織病理學(xué)檢查結(jié)果(HE×100)

3 討論

腹腔注射醋酸能刺激臟層和壁層腹膜，引起面積較大、時間較長的炎性疼痛，可較好的測定藥物對動物痛閾提高的程度。rWLC在鎮(zhèn)痛試驗(yàn)中對于醋酸引起的扭體反應(yīng)具有明顯的抑制作用;從該藥明顯提高疼痛抑制率看，rWLC鎮(zhèn)痛作用的強(qiáng)度達(dá)到了哌替啶的4/10～7/10，說明rWLC具有較好的鎮(zhèn)痛作用。rWLC處方中的延胡及其活性成分等具有一定的鎮(zhèn)痛作用，可能是rWLC產(chǎn)生較強(qiáng)鎮(zhèn)痛作用的原因之一;在抗炎試驗(yàn)結(jié)果中顯示，rWLC能明顯抑制蛋清引起的足趾腫脹程度，其腫脹與地塞米松相當(dāng)，表明 rWLC具有很強(qiáng)的抗炎作用，但其抗炎作用及其機(jī)制還有待進(jìn)一步探討。

在藥物的安全性評價中，LD50是指使動物半數(shù)致死的劑量，是藥物急性毒性評價的一個重要指標(biāo)，LD50值越大，提示藥物毒性越低［6］。在LD50測定試驗(yàn)中，由于藥物溶解度及灌胃劑量的最大限制，1次灌胃給予最大濃度、最大給藥體積的rWLC 8 g/kg，觀察14 d，小鼠均存活，無1死亡，且一般狀況良好，體重、攝食量、皮毛、行為、分泌物等均無異常變化，不能計(jì)算出rWLC的LD50，表明該藥急性毒性較低，安全范圍可能較大。最大給藥量測定實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，小鼠1天3次灌胃給藥20%、15%和7.5%的 rWLC 0.4 mL/10g，觀察14 d，小鼠均存活，且一般狀況良好，體重和攝食量隨時間延長明顯增加，與空白組比較無明顯差異;特別值得注意的是rWLC的最大給藥量為24 g/kg/d，相當(dāng)于臨床成人擬推薦用藥量(50mg/kg/d)的480倍，試驗(yàn)中所用的低劑量也相當(dāng)于臨床擬用藥劑量的120倍，進(jìn)一步說明rWLC無明顯急性毒性，安全性較高。在重要臟器的組織病理學(xué)檢查中發(fā)現(xiàn)，rWLC對小鼠心、肝、脾、肺、腎等組織器官的組織病理學(xué)無明顯影響，進(jìn)一步證實(shí)rWLC急性毒性低，安全性較高。這些結(jié)果為rWLC進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供了急性毒性評價的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為藥效學(xué)動物實(shí)驗(yàn)、臨床用藥劑量范圍和長期毒性試驗(yàn)的劑量設(shè)計(jì)提供了重要參考。

［1］余麗梅，鄧江，文國容，等.胃樂膠囊對實(shí)驗(yàn)性潰瘍的作用［J］.遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2001，24(5):388 －399.

［2］徐叔云，卞如濂，陳修.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2002:905.

［3］范念斯，楊軍英，趙青青.黃藤合劑的急性毒性和藥效學(xué)研究［J］.鄭州大學(xué)學(xué)報(bào):理學(xué)版，2011，43(3):111 －123.

［4］王燕燕，陳超，楊洪發(fā).虎參痛風(fēng)膠囊對大鼠足腫的抗炎作用［J］.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2005，25(3):216－218.

［5］羅萌，楊思進(jìn)，宋志宙，等.蛭龍活血通淤膠囊對小鼠的急性毒性實(shí)驗(yàn)［J］.時珍國醫(yī)國藥，2009，20(7):1639 －1641.

［6］陳奇.中藥藥理研究方法學(xué)［M］.第2版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2006:109.