韓巖巖

(遵義醫(yī)學院公共衛(wèi)生學院，貴州遵義 563099)

11β－羥基類固醇脫氫酶1型(11β－HSD1，基因名字HSD11B1)為糖皮質激素的代謝酶，它催化糖皮質激素C11位的酮基與羥基之間的氧化還原反應，使無活性的17羥11脫氫皮質酮(可的松)轉化為有生物活性的皮質醇(人類)，主要作用是調節(jié)局部組織糖皮質激素的濃度［1］。在嚙齒類，它催化皮質酮與脫氫皮質酮之間的轉化［2］。11β－HSD1的表達和活性改變可導致糖皮質激素代謝紊亂，易引發(fā)肥胖癥、2型糖尿病、高血壓等代謝綜合征［3－5］。直到最近人們才發(fā)現(xiàn)，11β － HSD1基因的表達調控是由選擇性啟動子控制的［6］，分別是位于遠端的啟動子1(Promoter 1，P1)和位于近端的啟動子2(Promoter 2，P2)。目前關于11β－HSD1選擇性啟動子的研究不是很多。糖皮質激素是已知HSD11B1的調節(jié)子，可以誘導HSD11B1的表達。本文主要是探討糖皮質激素(GC)誘導HSD11B1表達其選擇性啟動子的使用情況，為進一步研究GC誘導的HSD11B1表達情況和基因的轉錄調控模式奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng) A549細胞(肺腺癌細胞系)培養(yǎng)在37℃5%二氧化碳90%濕度環(huán)境中，用DMEM培養(yǎng)液，添加10%的胎牛血清、青霉素(100 U/mL)、鏈霉素(0.1 mg/mL)和谷氨酰胺(2 mM)，所有培養(yǎng)細胞的產(chǎn)品來自PAA實驗室(Coelbe，德國)。

1.2 提取基因組DNA 用機械法收集單層A549細胞，然后加入1 mL細胞裂解液?；蚪MDNA的提取采用酚/氯仿法:懸浮液中加入1 mL的苯酚旋渦攪拌1 min。將懸浮液在室溫下孵育5 min，然后13 000 r/min離心5 min。上相液體被轉移到一個新的離心管，加氯仿1 mL旋渦攪拌1 min，混合物再以1 3000 r/min離心1 min(兩次)。上相液體被轉移到一個新的離心管，加入兩個體積的100%乙醇，然后在13 000 r/min離心10 min。片狀DNA顆粒用2 mL 70%乙醇洗滌，然后以13 000 r/min離心5 min。最后，DNA顆粒在室溫下干燥5 min，溶于500 μL TE緩沖液。

1.3 熒光報告載體的構建 克隆11β－HSD1遠端啟動子 1(P1，2.173 kb)和近端啟動子(P2，2.506 kb)，用A549細胞基因組DNA為模板，引物(見表1)。將PCR產(chǎn)物克隆入pCR2.1－TOPO載體的多克隆位點，通過測序鑒定插入片段。然后將P1和P2片段再次克隆到pGL3熒光報告載體，獲得目的熒光報告載體pGL3－P1和pGL3－P2。

1.4 半定量RT－PCR A549細胞用6孔板培養(yǎng)，傳代1 d后，待細胞匯合度達90%，加入皮質醇(Cortisol，100 nM)和地塞米松(Dexamethasone，Dex，100 nM)，48 h后，提取細胞總RNA用Master Pure RNA純化試劑盒。反轉錄反應用2 μg總RNA，然后根據(jù)反轉錄試劑盒的說明操作。取1 μL反轉錄產(chǎn)物進行半定量的PCR反應，加入1 U的Phire Hotstart DNA聚合酶，1 mM的dNTP Mix，1倍的Phire反應緩沖液，0.2 μM 的引物(見表1)。PCR反應條件如下:初始變性時間98℃30 s;25個周期循環(huán)，98℃變性10 s，退火60℃15 s，延伸72℃15 s;最后一個延伸時間72℃10 min。最后，PCR產(chǎn)物全部用于1%凝膠電泳分離。

表1 實驗所用引物

1.5 細胞轉染 A549細胞用96孔板培養(yǎng)，傳代1 d后，待細胞匯合度達90%，用無抗生素細胞液換液。質粒DNA(pGL3－P1和pGL3－P2，50 ng)分別用 25 μL Opti－ MEM Reduced Serum Medium 稀釋待用，細胞轉染試劑 LipofectamineTM2000(Invitrogen GmbH，Germany)0.3 μL 用 25 μL Opti－MEM Reduced Serum Medium稀釋，混合后室溫放置5 min。將已稀釋好的質粒DNA與稀釋好細胞轉染試劑混合后室溫放置20 min，然后將50 μL的混合物加入每孔中。將細胞板放入37℃細胞培養(yǎng)箱，4 h后，將稀釋好的50 μL含有糖皮質激素Cortisol(100 nM)和 Dexamethasone(Dex，100 nM)的溶液，加入細胞培養(yǎng)孔中，將細胞放入細胞培養(yǎng)箱進行孵育。

1.6 熒光報告基因分析 在細胞轉染后48 h，將96孔細胞培養(yǎng)板移出細胞培養(yǎng)箱移去細胞培養(yǎng)液，每孔加入75 μL細胞培養(yǎng)液。然后，每孔加入75 μL Luciferase Reagent(Promega，Germany)，將細胞板上下左右來回輕輕晃動，10 min。然后將細胞裂解物轉移到96孔白色微孔板。測量firefly發(fā)光用 GENios Pro microplate reader(Tecan GmbH，Germany)。取出平板每孔加入75 μL Dual－GloTM＆ Glo Reagent(Promega，Germany)，輕輕混合后，放置10 min。Renilla發(fā)光測量使用GENios Pro microplate reader(Tecan GmbH，Germany)。結果分析:Relative luciferase activity(%)= RLUfirefly/RLURenilla(%)，其中RLU代表相對發(fā)光單位。

2 結果

2.1 GC誘導HSD11B1 mRNA的表達 糖皮質激素(GC)例如地塞米松(dexamethasone，Dex)和皮質醇(cortisol)都是非常重要的HSD11B1的調節(jié)子，可以誘導HSD11B1的表達。為了探討GC誘導A549細胞中HSD11B1 mRNA的表達其選擇性啟動子的使用情況，設計特異性引物擴增來自不同啟動子的轉錄產(chǎn)物(見圖1)。A549細胞用地塞米松和皮質醇處理48 h后，用半定量－RT－PCR的方法檢測GC誘導后HSD11B1 mRNA的表達情況。結果顯示HSD11B1 mRNA表達顯著增加經(jīng)由選擇性啟動子P1和P2，但是P2要強于P1，GC主要通過介導P2誘導HSD11B1 mRNA表達(見圖2)。

圖1 設計引物檢測HSD11B1選擇性啟動子(P1和P2)的使用情況

2.2 GC誘導熒光報告基因蛋白的表達 從A549細胞基因組中克隆11β－HSD1的兩個啟動子的基因序列，P1片段長為2.173 kb;P2片段長為2.506 kb(見圖3)。將含有P1和P2啟動子片段的熒光報告載體pGL3－P1和 pGL3－P2轉染到A549細胞。經(jīng)地塞米松和皮質醇處理后，檢測熒光報告載體表達情況，結果顯示，GC誘導的P2熒光報告載體相對熒光活性顯著增加，然而P1熒光報告載體相對熒光活性沒有明顯變化(見圖4)。

圖2 半定量－RT－PCR檢測HSD11B1轉錄產(chǎn)物

圖3 HSD11B1選擇性啟動子P1和P2的PCR產(chǎn)物

圖4 GC誘導熒光報告基因的表達

3 討論

一直以來人們對HSD11B1基因的啟動子研究比較少，最近人們研究發(fā)現(xiàn)調控HSD11B1基因表達的啟動子是由選擇性啟動子決定的。選擇性啟動子是指基因上游調控區(qū)存在的多個啟動子區(qū)，每個啟動子所啟動的表達模式不同，這些啟動子的選擇性啟動在基因表達中起重要的調控作用。研究發(fā)現(xiàn)大約有52%的人類編碼基因含有2個或者多個選擇性啟動子，平均每個人類編碼基因含有3.1個選擇性啟動子［7］。最近人們對選擇性啟動子進行深入研究，發(fā)現(xiàn)選擇性啟動子在選擇性剪接基因調控中起到了重要的調控作用［8］。HSD11B1基因表達也是由選擇性啟動子調控的，研究發(fā)現(xiàn)啟動子P2在大多數(shù)組織和細胞基因轉錄中占主導地位，包括人類肝臟、皮下脂肪組織和幾種常用的細胞系如 Caco－2、C2C12 和3T3 －L1［9］。轉錄來自于 P1調控的主要出現(xiàn)在人類的腫瘤細胞，如A431和HT－29。此外，C2C12成肌細胞和3T3－L1脂肪細胞分化的過程中，HSD11B1基因轉錄水平增加主要來自于P2轉錄增加［9］。本試驗應用A549細胞系是人肺腺癌細胞系，通過實驗發(fā)現(xiàn)選擇性啟動子P2在肺腺癌細胞中GC誘導HSD11B1表達過程中起主導作用。

此外，本試驗結果顯示糖皮質激素皮質醇和地塞米松都可以誘導11β－HSD1在轉錄和翻譯水平表達增加，其中皮質醇是11β－HSD1酶氧化還原的產(chǎn)物，地塞米松是皮質醇衍生物，兩者勻可導致11β－HSD1酶活性增加。研究發(fā)現(xiàn)11β－HSD1酶活性增加，可導致機體代謝紊亂易發(fā)生糖尿病、肥胖癥、高血壓、胰島素抵抗和骨質疏松等代謝疾?。?0－14］。目前，糖皮質激素常用于臨床疾病的治療，糖皮質激素如皮質醇和地塞米松，臨床上常用于抗炎、抗過敏、抗病毒和免疫抑制作用的治療。短期(7 d以內)適量使用GC幾乎無副作用，但是長期使用GC副作用明顯，會導致物質代謝紊亂，表現(xiàn)為新陳代謝的變動，如血糖升高、食欲增加、體重上升、性欲減退以及極度疲勞等。長期應用糖皮質激素會導致向心性肥胖、糖尿病、高血壓等疾病的發(fā)生［15－16］。綜上所述，無論是糖皮質激素誘導11β－HSD1活性增加還是糖皮質激素本身長期應用對人體都有不利的影響。

本試驗通過研究GC誘導HSD11B1基因表達，其選擇性啟動子的使用情況。結果發(fā)現(xiàn)，糖皮質激素誘導HSD11B1表達主要經(jīng)由選擇性啟動子P2，該結果為今后研究HSD11B1基因的轉錄調控模式奠定基礎。

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