蒲麗君，趙 珂，羅 勇

(川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心內(nèi)科，四川 南充 637000)

本刊網(wǎng)址:http://www.nsmc.edu.cn 作者投稿系統(tǒng):http://noth.cbpt.cnki.net 郵箱:xuebao@nsmc.edu.cn

高血壓作為一種臨床綜合征是目前心血管疾病死亡的最主要原因之一，其病理生理過程常常伴有左室肥厚。有研究證實(shí)，心臟在高負(fù)荷狀態(tài)下能量代謝的改變是心肌肥厚發(fā)生發(fā)展的機(jī)制之一。GLUTs 作為與糖代謝密切相關(guān)的跨膜糖蛋白，可能參與了心肌肥厚這一過程。近年來，有關(guān)羥甲基戊二酰輔酶A 還原酶抑制劑(hydroxy methylglutaryl coenzyme A reductase inhibitor，HMG-CoA 還原酶抑制劑)——他汀類藥物的研究表明:該類藥物除了本身的降脂效應(yīng)外，還具有獨(dú)立于調(diào)脂以外的多種效應(yīng)，包括:抗炎作用、保護(hù)血管內(nèi)皮功能、穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊、阻止或逆轉(zhuǎn)心室肥厚等作用［1－3］。但關(guān)于他汀類藥物影響自發(fā)性高血壓大鼠心肌組織GLUT4 表達(dá)的報(bào)道有限。本研究以自發(fā)性高血壓大鼠為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停^察阿托伐他汀對(duì)SHR 肥厚心肌中GLUT4 表達(dá)的影響，探討阿托伐他汀改善SHR心肌肥厚的作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

健康雄性SHR16 只和健康雄性Wistar-Kyoto 大鼠8 只，均為8 周齡，清潔級(jí)，體重范圍在120 ～150 g，購自于重慶藤清生物技術(shù)有限公司。將16只SHR 隨機(jī)分為:阿托伐他汀干預(yù)組(ATV 組，n =8)與SHR 模型對(duì)照組(SHR 組，n =8)。8 只Wistar-Kyoto 大鼠作為正常對(duì)照(WKY 組，n =8)。分籠飼養(yǎng)。ATV 組:阿托伐他汀藥物粉末按50 mg·kg－1·d－1標(biāo)準(zhǔn)灌胃;SHR 組與WKY 組:以等容量蒸餾水灌胃，連續(xù)10 周。

1.2 標(biāo)本采集

10 周后，所有大鼠統(tǒng)一稱重，以2.5%濃度的戊巴比妥鈉行腹腔注射麻醉，抽取腹主動(dòng)脈血2.0 mL，用于血脂檢測(cè)。后迅速處死，分離出心臟，生理鹽水沖洗，濾紙吸干水分，稱重。分離出左心室(包括室間隔)，稱重。在心尖剪取小塊心肌組織放入福爾馬林內(nèi)固定。余心室肌組織于液氮中速凍后分裝，轉(zhuǎn)至－80 ℃冰箱保存。

1.3 計(jì)算心肌肥厚指標(biāo)

將空腹條件下記錄的大鼠體重(BW)，及后記錄的全心重(HW)和左心重(LVW)，用于計(jì)算心肌肥厚指標(biāo)(HW/BW、LVW/BW)。

1.4 血脂測(cè)定

將上述腹主動(dòng)脈血靜置后離心，分離出的血清用全自動(dòng)化學(xué)分析儀測(cè)定甘油三酯(TG)、血漿總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平。

1.5 觀察心肌病理形態(tài)學(xué)

將福爾馬林內(nèi)固定的心肌組織制成蠟塊，再切成4 μm 厚度的切片，常規(guī)HE 染色，觀察心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。

1.6 免疫組化法觀察大鼠心肌細(xì)胞GLUT4 蛋白的分布

采用Elivison 兩步法免疫組織化學(xué)染色，一抗為鼠抗鼠GLUT4 單克隆抗體(購于美國Santa Cruz Bio Tech 公司)，二抗為羊抗鼠IgG(購于中國武漢博士德生物工程公司)。根據(jù)DAB 顯色試劑盒及SABC 試劑盒說明書操作。免疫組化光學(xué)顯微鏡下觀察染色情況，GLUT4 表達(dá)于胞膜及胞漿，GLUT4表達(dá)陽性的心肌細(xì)胞膜及胞漿呈棕黃色。

1.7 RT-PCR 法檢測(cè)大鼠心肌組織GLUT4mRNA 的表達(dá)水平

用TRNzol 法提取心肌組織RNA，用UV －2500紫外分光光度計(jì)分析RNA 純度，并調(diào)整各樣品總RNA 濃度為一致，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)物用于PCR。GLUT4 上游引物5'-TCTTCCTTCTATTTGCCGTCCTC-3'，下 游 引 物5'-TTCTGTACTGGGTTTCACCTCCTG-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度152 bp。內(nèi)參照beta-actin 上游引物5'-CACCCGCGAGTACAACCTTC-3'，下游引物5'-CCCATACCCACCATCAC ACC-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度207 bp。PCR 循環(huán)反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性5 min后，94 ℃變性30 s、退火(GLUT4 55 ℃，beta-actin58℃)30 s、72 ℃延伸30 s，共循環(huán)30 次，最后74 ℃延伸5 min。PCR 產(chǎn)物于1.75%瓊脂糖凝膠中電泳，然后在ET9970616AA 凝膠成像儀上對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，計(jì)算各目的條帶的灰度值，目的基因灰度與內(nèi)參照beta-actin 灰度的比值，即為mRNA 表達(dá)相對(duì)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS16.0 統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料以(±s)表示，組間比較采用單因素方差法分析，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 阿托伐他汀對(duì)血脂水平的影響

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，10 周后，ATV 組和SHR 組血清TC、TG、LDL-C 和HDL-C 的水平均低于WKY 組(P ＜0.05)，而ATV 組TC、TG、LDL-C 和HDL-C 雖低于SHR 組，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。各組大鼠的血脂水平結(jié)果，見表1。

表1 阿托伐他汀對(duì)大鼠血脂水平的影響

2.2 阿托伐他汀改善心肌肥厚

表2 阿托伐他汀對(duì)大鼠心肌肥厚的影響

將HW/BW 及LVW/BW 作為評(píng)價(jià)心肌肥厚的指標(biāo)。結(jié)果顯示:與WKY 組相比較，ATV 組和SHR組大鼠的心肌肥厚指標(biāo)顯著增高(P ＜0.05)。與SHR 組相比較，ATV 組心肌肥厚指標(biāo)明顯降低(P ＜0.05)。具體結(jié)果見表2。

2.3 心肌組織的病理形態(tài)學(xué)觀察

心肌組織HE 染色結(jié)果顯示:SHR 組大鼠的心肌細(xì)胞明顯肥大，心肌細(xì)胞形態(tài)欠規(guī)整，排列紊亂及心肌纖維出現(xiàn)部分?jǐn)嗔?。WKY 組大鼠的心肌細(xì)胞無明顯肥大，心肌細(xì)胞形態(tài)規(guī)整，排列整齊。ATV組大鼠的心肌細(xì)胞大小形態(tài)介于前兩組之間，與SHR 組相比較，細(xì)胞排列較規(guī)則，心肌纖維斷裂情況好轉(zhuǎn)，見圖1。

2.4 GLUT4 免疫組化檢測(cè)結(jié)果

免疫組化結(jié)果顯示:GLUT4 蛋白表達(dá)于大鼠心肌細(xì)胞膜及包漿，ATV 組和SHR 組GLUT4 蛋白的陽性表達(dá)率明顯低于WKY 組(P ＜0.05);阿托伐他汀干預(yù)后，與SHR 組比較，ATV 組GLUT4 的陽性表達(dá)率升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，見圖2。

2.5 GLUT4 RT-PCR 結(jié)果

研究結(jié)果顯示:ATV 組和SHR 組大鼠心肌組織中GLUT4 mRNA 的表達(dá)低于WKY 組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＜0.05)。阿托伐他汀干預(yù)后，GLUT4 mRNA的表達(dá)上升，ATV 組GLUT4 mRNA 高于SHR 組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)(表3 及圖3)。

表3 阿托伐他汀對(duì)GLUT4 表達(dá)的影響

3 討論

心臟是高耗能器官，為了滿足其能量需求，心臟能夠代謝各種各樣的底物，并且心臟的功能與底物的攝取和利用密切相關(guān)。在靜息狀態(tài)下，心臟70%的能量來自于脂肪酸的氧化，其余的主要來源于葡萄糖的氧化和酵解。在某些病理狀態(tài)下，如:局部缺血、心肌肥大、充血性心臟衰竭，為了滿足其代謝的需求，心臟越來越依賴于葡萄糖的代謝［4］。葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)率限制葡萄糖代謝。葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體(glucose transporters，GLUTs)作為葡糖糖轉(zhuǎn)運(yùn)的載體蛋白，它參與了心肌細(xì)胞的糖代謝，在肥厚心肌的代謝重構(gòu)中起著重要的作用。目前較多的研究表明，心肌肥厚是臨床上多種心血管疾病走向終末階段的共同的病理生理基礎(chǔ)，也是高血壓患者發(fā)生心血管事件及猝死的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［5］。因此，逆轉(zhuǎn)或者延緩心肌肥厚、改善心室重構(gòu)已成為現(xiàn)今高血壓治療降壓以外的新目標(biāo)。

GLUTs 是細(xì)胞膜上的一種載體蛋白，負(fù)責(zé)將葡萄糖分子從高濃度向低濃度運(yùn)載過細(xì)胞膜。目前已發(fā)現(xiàn)并鑒定了有14 種GLUT，成年大鼠心臟主要表達(dá)GLUT4［6－7］。GLUT4 低表達(dá)于初生心臟，之后隨年齡增長(zhǎng)其表達(dá)逐漸升高，并伴隨著糖分解代謝到氧化代謝的轉(zhuǎn)變，但在心肌肥厚的過程中出現(xiàn)GLUT4 的表達(dá)明顯減少［8］。有研究將小鼠心臟GLUT4 基因選擇性去除后，小鼠心臟發(fā)生代償性肥厚［9］;Li 等［10］研究進(jìn)一步證實(shí)心臟特異性GLUT4基因缺陷的小鼠也表現(xiàn)出心臟肥厚，并且可能與細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激有關(guān)。而Kaczmarczyk 等［11］認(rèn)為只有心臟GLUT4 表達(dá)水平降至其正常水平的95 ﹪以下時(shí)才會(huì)出現(xiàn)心肌肥厚，其可能機(jī)制是GLUT4 表達(dá)的降低會(huì)導(dǎo)致肥厚基因β-肌球蛋白重鏈及B 型鈉尿肽(BNP)表達(dá)的增加［12］。在本實(shí)驗(yàn)中，SHR 組高血壓大鼠肥厚心肌中GLUT4 mRNA 及其蛋白的表達(dá)低于WKY 組(P ＜0.05)，與上述研究結(jié)果相同，這說明GLUT4 表達(dá)的下調(diào)與心肌肥厚的進(jìn)展存在一定關(guān)聯(lián)。

他汀類藥物是目前臨床上最強(qiáng)效的降膽固醇藥物之一，其在心血管病治療中的作用已被全世界公認(rèn)，成為心腦血管疾病治療和預(yù)防的重要藥物［13］。阿托伐他汀作為最新一代人工合成的HMG-CoA 還原酶抑制劑，與其它他汀相比較，起效更快，并且單獨(dú)用藥即可有效降低血脂［14］。本實(shí)驗(yàn)中，血清TC、TG、LDL－C 和HDL－C 的水平在ATV 組和SHR 組之間比較無顯著性差異(P ＞0.05)，可能與實(shí)驗(yàn)樣本數(shù)量較少及阿托伐他汀干預(yù)時(shí)間較短有關(guān)。

阿托伐他汀除了本身的降脂效應(yīng)外，還具有獨(dú)立于調(diào)脂以外的的其他作用，稱之為他汀類藥物的多效性［15］。近年研究發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀還可通過抗氧化作用、抗炎反應(yīng)延緩高血壓心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展［2－3］。目前就阿托伐他汀是否對(duì)肥厚心肌中GLUT4 的表達(dá)存在影響的報(bào)道較少。在本實(shí)驗(yàn)中，阿托伐他汀對(duì)SHR 進(jìn)行干預(yù)后，其肥厚心肌中GLUT4 的表達(dá)上調(diào)，在ATV 組高于SHR 組(P ＜0.05)，并且心肌肥厚得到改善，說明阿托伐他汀可上調(diào)肥厚心肌中GLUT4 的表達(dá)，通過增加心肌葡萄糖利用，對(duì)心室重構(gòu)時(shí)發(fā)生的慢性能量缺乏起代償作用，以此改善心室重構(gòu)，并且這一過程與阿托伐他汀降血脂的作用無關(guān)。

在本研究中，我們證實(shí)了阿托伐他汀能夠抑制或逆轉(zhuǎn)自發(fā)性高血壓大鼠心肌的肥厚，且獨(dú)立于調(diào)脂作用之外。而上調(diào)GLUT4 的表達(dá)可能是阿托伐他汀改善心肌重構(gòu)的機(jī)制之一。為臨床他汀類藥物應(yīng)用于高血壓的治療提供新的依據(jù)。

［1］ Liao JK.Effects of statins on 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme a reductase inhibition beyond low-density lipoprotein cholesterol［J］.Am J Cardiol，2005，96(5):24 －33

［2］ Lu JC，Cui W，Zhang HL，et al.Additive beneficial effects of amlodipine and atorvastatin in reversing advanced cardiac hypertrophy in elderly spontaneously hypertensive rats［J］.Clin Exp Pharmacol Physiol，2009，36(11):1110 －1119

［3］ Ge CJ，Lu SZ，Chen YD，et al.Synergistic effect of amlodipine and atorvastatin on blood pressure，left ventricular remodeling，and C-reactive protein in hypertensive patients with primary hypercholesterolemia［J］.Heart Vessels，2008，23(2):91 －95

［4］ Wang HY，Pu JL.Changes of myocardial enzymes related to glycolysis and fatty acid metabolism in chronic myocardial ischemia:experiment with pigs［J］.Zhonghua Yi Xue Za Zhi，2008，88(31):2209 －2213

［5］ Gosse P，Cremer A，Vircoulon M，et al.Prognostic value of the extent of left ventricular hypertophy and its evolution in the hypertensive patient［J］.J Hypertens，2012，30(12):2403 －2409

［6］ Wood IS，Trayhurn P.Glucose transporters (GLUT and SGLT):expanded families of sugar transport proteins［J］.Br J Nutr，2003，89(1):3 －9

［7］ Thorens B，Mueckler M.Glucose transporters in the 21st Century［J］.Am J Physiol Endocrinol Metab，2010，298(2):141 －145

［8］ Abel ED，Kaulbach HC，Tian R，et al.Cardiac hypertrophy with preserved contractile function after selective deletion of GLUT4 from the heart［J］.J Clin Invest，1999，104(12):1703 －1714

［9］ Huggins CE，Domenighetti AA，Ritchie ME，et al.Functional and metabolic remodelling in GLUT4-deficient hearts confers hyper-responsiveness to substrate intervention［J］.J Mol Cell Cardiol，2008，44(2):270 －280

［10］ Li Y，Wende AR，Nunthakungwan O，et al.Cytosolic，but not mitochondrial，oxidative stress is a likely contributor to cardiac hypertrophy resulting from cardiac specific GLUT4 deletion in mice［J］.FEBS J，2012，279(4):599 －611

［11］ Kaczmarczyk SJ，Andrikopoulos S，F(xiàn)avaloro J，et al.Threshold effects of glucose transporter-4(GLUT4) deficiency on cardiac glucose uptake and development of hypertrophy［J］.J Mol Endocrinol，2003，31(3):449 －459

［12］ Ritchie RH，Quinn JM，Cao AH，et al.The antioxidant tempol inhibits cardiac hypertrophy in the insulin-resistant GLUT4-deficient mouse in vivo［J］.J Mol Cell Cardiol，2007，42(6):1119 －1128

［13］ Arca M，Gaspardone A.Atorvastatin efficacy in the primary and secondary prevention of cardiovascular events［J］.Drugs，2007，67(Suppl 1):29 －42

［14］ Daviqnon J.Advances in drug treatment of dyslipidemia: focus on atorvastatin［J］.Can J Cardiol，1998，14(Suppl B):28 －38

［15］ Athyros VG，Kakafika AI，Tziomalos K，et al.Pleiotropic effects of statins—clinical evidence［J］.Curr Pharm Des，2009，15(5):479 －489