宋必衛(wèi)，駱錢(qián)芬

（浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，浙江杭州310032）

BAPTA-AM對(duì)OGD-再灌致Hep G-2細(xì)胞損傷的保護(hù)作用研究

宋必衛(wèi)，駱錢(qián)芬

（浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，浙江杭州310032）

觀察BAPTA-AM抗OGD-再灌對(duì)Hep G-2細(xì)胞的損傷作用及其機(jī)制.在氧/糖剝奪環(huán)境中培養(yǎng)細(xì)胞12 h后復(fù)糖復(fù)氧，檢測(cè)培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶（LDH）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）及谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）的活性，MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力，Annexin V-EGFP/PI熒光染色檢測(cè)細(xì)胞死亡率，A23187拮抗實(shí)驗(yàn)及Fura-2/AM測(cè)定細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度等方法，評(píng)價(jià)BAPTA-AM抗氧/糖剝奪-再灌注致Hep G-2細(xì)胞損傷的作用.BAPTA-AM能明顯抑制OGD-再灌引起的Hep G-2細(xì)胞培養(yǎng)液中的LDH、ALT、AST水平的升高，抑制Hep G-2細(xì)胞的壞死和細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度的升高，明顯提高Hep G-2細(xì)胞活力，A23187減弱BAPTA-AM保肝作用.BAPTA-AM通過(guò)降低細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度，明顯減輕OGD-再灌對(duì)HepG-2細(xì)胞的損傷.

BAPTA-AM；Hep G-2細(xì)胞；OGD-再灌

原發(fā)性肝癌是我國(guó)最常見(jiàn)且惡性程度最高的腫瘤之-，每年約有14萬(wàn)例患者死于肝癌，占我國(guó)癌癥死亡率的第二位.肝切除和肝移植是肝臟腫瘤的惟一有效手段.肝移植必然要經(jīng)歷缺血-再灌注過(guò)程，導(dǎo)致肝缺血-再灌注損傷（Hepatic ischemiareperfusion injury，HIRI），引起細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化、細(xì)胞器結(jié)構(gòu)損傷和代謝障礙，直接導(dǎo)致術(shù)后肝功能不全等致命并發(fā)癥形成.肝移植病人中5%～30%出現(xiàn)原發(fā)性供肝無(wú)功能或功能不良，是僅次于免疫排斥的第二位再移植失敗原因，其發(fā)生與供肝的切取、保存和再灌注所致的損傷密切相關(guān)［1-2］.此外，其它肝手術(shù)、肝臟嚴(yán)重炎癥，肝血栓、肝外傷等疾病也能導(dǎo)致肝缺血缺氧損傷.盡管現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)肝損傷的研究比較深入，已從多方面探討了肝損傷的發(fā)生機(jī)制，但保肝藥物療效仍難盡人意，尋找能有效防治肝缺血缺氧-再灌損傷藥物，具有重要臨床意義.

鈣超載是公認(rèn)的細(xì)胞損傷、死亡的共同環(huán)節(jié)［3］. BAPTA-AM［1，2-bis（2-aminophenoxy）ethane-N，N，N′N(xiāo)′-tetraacetic acid］是一種具有高選擇性的高效鈣絡(luò)合劑，用于控制細(xì)胞內(nèi)鈣水平以研究鈣離子對(duì)各種細(xì)胞功能調(diào)節(jié)［4-5］，能有效地降低細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度，因此推測(cè)其能減輕HIRI所致的細(xì)胞損傷，挽救瀕危細(xì)胞.本研究以O(shè)GD-再灌損傷Hep G-2細(xì)胞，通過(guò)測(cè)定細(xì)胞活力、凋亡率以及酶學(xué)指標(biāo)來(lái)論證BAPTA-AM對(duì)肝細(xì)胞的保護(hù)作用.

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 細(xì)胞株

Hep G-2細(xì)胞株，購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司.

1.1.2 藥品與試劑

BAPTA-AM脂質(zhì)體（合肥恒星科技公司提供）；鹽酸維拉帕米注射液（上海禾豐制藥有限公司，批號(hào)110421）；RPMI.1640培養(yǎng)液、小牛血清、0.25%胰蛋白酶、PBS、DMSO（上海吉諾醫(yī)藥生物技術(shù)有限公司）；MTT（Sigma）；乳酸脫氫酶（LDH）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）試劑盒（南京建成生物工程研究所）；Annexin V-EGFP檢測(cè)試劑盒（南京凱基生物技術(shù)有限公司）；A23187（Sigma）、Fura-2/AM鈣離子熒光探針（海門(mén)市碧云天生物技術(shù)研究所）.

1.1.3 儀 器

垂直流超凈臺(tái)（ESCO，SCV-4A1）；CO2培養(yǎng)箱（Thermo Electron Corporation，F(xiàn)onma 3111）；倒置光學(xué)顯微鏡（Nikon Eclipse，型號(hào)TS100-F DH1）；熒光顯微鏡（Leica Devices）；酶標(biāo)儀（Molecular Devices，M2e）；離心機(jī)（Heraeus，LDZ5-2）.

1.2 方 法

1.2.1 OGD-再灌致細(xì)胞損傷模型的建立

將Hep G-2細(xì)胞以104個(gè)/孔接種于96孔培養(yǎng)板，RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后換無(wú)糖1640培養(yǎng)液，置于密閉缺氧盒中，37℃下持續(xù)通入N240 min后同時(shí)關(guān)閉進(jìn)、出氣口，置于37℃恒溫孵箱中培養(yǎng)，缺氧時(shí)間設(shè)置為4，8，12，16 h.打開(kāi)缺氧盒以復(fù)氧，加入常規(guī)培養(yǎng)濃度葡萄糖，5%CO2孵箱中正常培養(yǎng)6 h，建立OGD-再灌模型［6-7］.正常對(duì)照組不作任何處理.每組設(shè)8個(gè)復(fù)孔.MTT法檢測(cè)不同氧/糖剝奪時(shí)間對(duì)Hep G-2細(xì)胞活力的影響以確定合適損傷時(shí)間制備細(xì)胞損傷模型.

1.2.2 BAPTA-AM對(duì)OGD-再灌誘導(dǎo)HepG-2細(xì)胞損傷的影響

細(xì)胞培養(yǎng)同1.2.1.分組及處理見(jiàn)圖1，每組設(shè)8個(gè)復(fù)孔.氧/糖剝奪條件下培養(yǎng)12 h后，復(fù)氧復(fù)糖，繼續(xù)培養(yǎng)6 h.正常對(duì)照組不作特殊處理.MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力，收集培養(yǎng)上清液檢測(cè)AST，ALT，LDH活性.細(xì)胞活力為

圖1 BAPTA-AM抗OGD-再灌所致HepG-2細(xì)胞損傷（MTT法）±s，n=8）Fig.1 The effects of BAPTA-AM on HepG-2 cells against the injuries induced by deprivation of O2and glucose±s，n=8）

1.2.3 Annexin V-EGFP/PI熒光染色觀察BAPTA-AM對(duì)細(xì)胞死亡的影響

分組及處理同1.2.2.復(fù)氧、糖6 h后，棄上部培養(yǎng)液并用PBS清洗兩次，加500μL Binding Buffer后再加入Annexin V-EGFP和Propidium Iodide（PI）各5μL，室溫避光反應(yīng)5 min，熒光顯微鏡觀察結(jié)果，計(jì)數(shù)凋亡早期、凋亡中晚期及壞死細(xì)胞數(shù)［8-9］.

1.2.4 A23187拮抗BAPTA-AM抗Hep G-2細(xì)胞OGD-再灌損傷的作用

細(xì)胞處理同1.2.2，分組見(jiàn)圖2.保護(hù)組和A23187組分別加入相應(yīng)濃度的藥物.正常對(duì)照組不作特殊處理，其余各組均置于氧/糖剝奪環(huán)境中培養(yǎng)12 h，再?gòu)?fù)氧復(fù)糖培養(yǎng)6 h，MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力［10］.

圖2 A23187對(duì)模型組和保護(hù)組的細(xì)胞活力的影響±s，n=8）Fig.2 Effects of A23187 to model group and protectivegroups on viabilities of HepG-2 cells±s，n=8）

1.2.5 細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度的測(cè)定

分組及處理同1.2.2.同前法清洗細(xì)胞3次，加入終濃度為5μmol/L的Fura-2/AM.37℃避光溫育30 min，同法清洗3次以去除多余的Fura-2/ AM.設(shè)定激發(fā)波長(zhǎng)為340 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為510 nm，測(cè)定熒光強(qiáng)度.再加入0.4%的Triton X-100及5 mmol/L的CaCl2后測(cè)定最大熒光強(qiáng)度值Fmax，在Fmax的基礎(chǔ)上加入10 mmol/L的EGTA后的測(cè)定值為最小熒光強(qiáng)度值Fmin.按以下公式計(jì)算細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度：Kd（F-Fmin）/（Fmax-F）；Kd=224 nmol/L，為Fura-2與Ca2+的解離常數(shù)［11-12］（每個(gè)樣本測(cè)定后均需減去自發(fā)熒光再進(jìn)行計(jì)算）.

1.2.6 統(tǒng)計(jì)處理

采用Graph Pad Prism軟件（One-way ANOVA）處理，數(shù)據(jù)用±s表示，以p＜0.05為差異有顯著性意義.

2 結(jié) 果

2.1 OGD-再灌致細(xì)胞損傷模型的建立

如圖3所示，固定復(fù)氧/糖時(shí)間為6 h.細(xì)胞活力隨著氧/糖剝奪時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸減小.氧/糖剝奪12 h時(shí)，細(xì)胞的活力降低至正常對(duì)照組的59%，二者間差異極顯著性（P＜0.001）.因此選用氧/糖剝奪12 h來(lái)制作HepG-2細(xì)胞損傷模型.

圖3 OGD時(shí)間對(duì)HepG-2細(xì)胞活性的影響±s，n=8）Fig.3 Effect of deprivation of O2&glucose on viabilities of Hep G-2 cells（±s，n=8）

2.2 BAPTA-AM抗OGD-再灌所致HepG-2細(xì)胞損傷

從圖1可看出：Hep G-2細(xì)胞缺糖缺氧12 h后，細(xì)胞活性嚴(yán)重受損，與正常對(duì)照組相比，差異極明顯（P＜0.001）.無(wú)論是預(yù)防性（缺糖缺氧前）給藥（圖1a），還是治療性給藥（圖1b），BAPTA-AM均可呈劑量依賴(lài)性地減輕細(xì)胞損傷，在3 nmol/L時(shí)，作用達(dá)峰值（活力分別由模型組的52.9%和55.9%上升到73.9%和73%）.預(yù)防性給予維拉帕米對(duì)Hep G-2細(xì)胞有保護(hù)作用但需要更高濃度（100 nmol/L），但治療性用藥則無(wú)明顯作用.該結(jié)果證明：BAPTAAM對(duì)肝細(xì)胞的保護(hù)好，且明顯優(yōu)于維拉帕米.

2.3 BAPTA-AM改善HepG-2細(xì)胞損傷所致的酶學(xué)指標(biāo)改變

Hep G-2細(xì)胞經(jīng)OGD-再灌損傷后，細(xì)胞內(nèi)酶釋放，導(dǎo)致培養(yǎng)上清液中的ALT、AST和LDH水平明顯升高.預(yù)防性給予BAPTA-AM，可濃度依賴(lài)性抑制ALT，AST和LDH活性的升高，當(dāng)BAPTAAM為3 nmol/L時(shí)效果最佳（圖4）.

2.4 AnnexinV-EGFP熒光染色觀察BAPTA-AM抗細(xì)胞死亡作用

凋亡和壞死是細(xì)胞的兩種死亡方式.細(xì)胞經(jīng)OGD-再灌損傷后，在熒光顯微鏡下觀察，可看見(jiàn)大部分細(xì)胞被染色.部分細(xì)胞固縮變小，發(fā)出綠色熒光，為凋亡早期狀態(tài)；部分細(xì)胞裂解成碎塊，并同時(shí)發(fā)出綠色熒光和紅色熒光，表明細(xì)胞已進(jìn)入凋亡晚期；細(xì)胞膨大，只發(fā)出紅色熒光的，為壞死細(xì)胞.模型組細(xì)胞總死亡率高達(dá)（39.2±2.4）%.加入3 nmol/L BAPTA-AM后，出現(xiàn)紅色熒光標(biāo)記的細(xì)胞明顯減少，被染的細(xì)胞基本處于凋亡早期（綠染）（圖5），細(xì)胞的總死亡率顯著性下降（25.2± 4.3）%，尤其是壞死率，由模型組的（63.8± 4.2）%下降了到（32.0±2.3）%.該結(jié)果表明OGD-再灌導(dǎo)致HepG-2細(xì)胞壞死與凋亡，且以壞死為主.BAPTA-AM能極顯著抑制OGD-再灌所致的細(xì)胞壞死與凋亡（表1）.

2.5 A23187拮抗BAPTA-AM對(duì)HepG-2細(xì)胞的保護(hù)作用

由圖2可知：A23187（1μg/m L）顯著加重OGD-再灌所致的細(xì)胞損傷，拮抗BAPTA-AM的細(xì)胞保護(hù)作用，提示BAPTA-AM通過(guò)減輕鈣超載機(jī)制保護(hù)細(xì)胞.

2.6 BAPTA-AM對(duì)細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度的影響

經(jīng)OGD-再灌損傷后，HepG-2細(xì)胞內(nèi)的游離鈣濃度較正常對(duì)照組有明顯升高，從（124.90±27.17）nmol/L上升到（237.36±38.49）nmol/L，約升高了1倍.BAPTA-AM濃度依賴(lài)性降低劑細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度.當(dāng)BAPTA-AM為3 nmol/L時(shí)，游離鈣濃度達(dá)到（146.78±24.31）nmol/L，與正常對(duì)照組接近.該結(jié)果進(jìn)一步表明BAPTA-AM通過(guò)減輕鈣超載機(jī)制保護(hù)細(xì)胞（圖6）.

圖4 BAPTA-AM改善Hep G-2細(xì)胞損傷所致的酶學(xué)指標(biāo)變化±s，n=8）Fig.4 Effects of BAPTA-AM on AST、ALT和LDH levels in supernatant±s，n=8）

圖5 Annexin V-EGFP熒光染色后的HepG-2細(xì)胞Fig.5 The morphology of HepG-2 cells labeled by AnnexinV-EGFP/PI

表1 BAPTA-AM對(duì)HepG-2細(xì)胞凋亡和壞死的影響1）±s，n=8）Table 1 Effects of BAPTA-AM on death rate of HepG-2 cells±s，n=8）

表1 BAPTA-AM對(duì)HepG-2細(xì)胞凋亡和壞死的影響1）±s，n=8）Table 1 Effects of BAPTA-AM on death rate of HepG-2 cells±s，n=8）

注：1）與模型組相比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；2）凋亡早期細(xì)胞為可逆性損傷，不納入死亡細(xì)胞統(tǒng)計(jì).

58.3±22.0 4 41.6±22.0模型 14.9±0.3 39.2±2.4 36.2±4.2 6 63.8±4.2 BAPTA-AM 0.3 14.2±2.5 38.0±2.9 42.9±1.3 57.1±1.3 1 15.3±3.0 29.1±5.5*57.1±3.0 42.9±3.0 3 20.1±3.4 25.2±4.3**68.0±2.3*32.0±2.3*維拉帕米晚期凋亡 壞死空白對(duì)照 3.8±0.6***2.8±0.6***組別 劑量/（nmol·L-1） 早期凋亡率/% 總死亡率/% 死亡構(gòu)成比2）/% 100 20.4±1.5 30.5±3.1 53.0±3.4 47.0±3.4

圖6 BAPTA-AM對(duì)HepG-2細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度的影響±s，n=8）Fig.6 Effects of BAPTA-AM on cytoplasmic free Ca2+concentrations±s，n=8）

3 結(jié) 論

HIRI是指由于各種原因?qū)е赂闻K血流中斷、不足等造成肝臟缺血，當(dāng)再進(jìn)行灌注，肝臟血供恢復(fù)后，不僅不能使肝臟功能恢復(fù)，反而使肝細(xì)胞功能障礙及結(jié)構(gòu)破壞加重的現(xiàn)象，多發(fā)生于肝移植、肝葉切除等復(fù)雜肝臟外科手術(shù)中.目前，各種預(yù)防及治療措施已逐漸被運(yùn)用，主要有：1）缺血預(yù)處理和缺血后處理：增加肝臟對(duì)缺血的耐受性；2）減輕HIR的藥物：如抗氧化劑（川芎嗪、丹參、銀杏葉）、鈣通道阻滯劑（維拉帕米、三七總皂甙）、PAF拮抗劑（山莨菪堿、海風(fēng)藤酮）、細(xì)胞因子活性抑制劑（賴(lài)氨匹林）、蛋白酶體抑制劑（烏司他?。┑鹊?，但這些措施效果并不顯著.因此，研究開(kāi)發(fā)針對(duì)HIRI的有效藥物，降低病死率，是急需解決的重大課題.

本實(shí)驗(yàn)采用OGD-再灌損傷建立肝缺血再灌注損傷模型，發(fā)現(xiàn)OGD-再灌損傷HepG-2細(xì)胞后，細(xì)胞活力顯著下降，培養(yǎng)上清液中AST、ALT、LDH水平明顯升高，細(xì)胞內(nèi)Ca2+大大升高，BAPTA-AM能顯著減輕上述損傷性變化.Annexin V-EGFP熒光染色表明OGD-再灌能誘導(dǎo)Hep G-2細(xì)胞出現(xiàn)典型的細(xì)胞凋亡與壞死且以后者為主，BAPTA-AM則極明顯減少細(xì)胞壞死.本結(jié)果在細(xì)胞水平證BAPTA-AM對(duì)肝缺血-再灌損傷有上佳的防治作用，其最佳濃度為3 nmol/L，其作用機(jī)制是直接降低細(xì)胞內(nèi)鈣，減輕或消除鈣超載，與蔡雁［13］、付再林［14］等報(bào)道的BAPTA-AM抗肝細(xì)胞凋亡作用基本一致.大量研究證明，鈣超載和自由基形成二者互為因果，是缺血-再灌損傷的主要機(jī)制.BAPTA-AM能通過(guò)減輕鈣超載，大大降低自由基形成［15］.

本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)：經(jīng)典的鈣通道阻斷劑維拉帕米在高濃度時(shí)100 nmol/L，對(duì)OGD-再灌誘導(dǎo)的Hep G-2細(xì)胞損傷有預(yù)防作用但治療效果差.BAPTA-AM作用的效能和效價(jià)強(qiáng)度均高于維拉帕米.因此，一旦將BAPTA-AM用于臨床，療效會(huì)大大優(yōu)于維拉帕米.究其原因，可能在于二者作用不同：維拉帕米阻斷鈣通道，故能預(yù)防鈣超載的發(fā)生，但其不能直接降低細(xì)胞內(nèi)鈣，對(duì)已存在的鈣超載無(wú)效，自然臨床治療效果差.BAPTA-AM直接降低細(xì)胞內(nèi)鈣，減輕或消除鈣超載，故既可預(yù)防也能治療鈣超載損傷.BAPTA-AM有可能成為治療HIRI的有效治療藥，開(kāi)發(fā)前景極好.

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（責(zé)任編輯：陳石平）

Protection of Hep G-2 cell of BAPTA-AM against deprivation of O2and glucose/reperfusion-induced injury

SONG Bi-wei，LUO Qian-fen
（College of Pharmaceutical Science，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310032，China）

To study the protective effects and mechanism of BAPTA-AM on Hep G-2 cells against deprivation of O2and glucose/reperfusion-induced injury，oxygen-glucose deprivation followed by 12 h of reoxygenation-glucose reperfusion was applied to induce Hep G-2 cells injure at various concentrations of BAPTA-AM.The viabilities of Hep G-2 cells，the levels of ALT，AST，LDH were measured.Cell death was evaluated by Annexin V-EGFP/PI labeling method.Effects of A23187 against BAPTA-AM on viabilities of Hep G-2 cells was also measured.Cytoplasmic free Ca2+concentrations were tested by a Ca2+labeling indicator，F(xiàn)ura-2/AM.BAPTA-AM could significantly inhibit deprivation of O2and glucose/reperfusion-induced hepatocyte injury，prevent Hep G-2 cells from cytoplasm Ca2+concentrations increase and suppress necrosis.BAPTA-AM could effectively protect Hep G-2 cells against deprivation of O2and glucose/reperfusion induced injury.

BAPTA-AM；Hep G-2 cells；deprivation of O2and glucose/reperfusion

R965

A

1006-4303（2013）02-0133-05

2012-03-09

宋必衛(wèi)（1956-），男，安徽岳西人，教授，研究方向?yàn)榧?xì)胞和分子藥理學(xué)，E-mail：bwsong@zjut.edu.cn.