張飛，魏濤，劉寅，韓亞偉，何培新

(鄭州輕工業(yè)學(xué)院，食品與生物工程學(xué)院，河南鄭州，450002)

D-氨基酸作為重要的中間體，在食品添加劑、醫(yī)藥和農(nóng)藥等行業(yè)應(yīng)用，廣泛市場(chǎng)需求較大，已逐漸成為氨基酸行業(yè)新的發(fā)展方向［1－3］。D-丙氨酸作為原料可用于合成甜味劑阿力甜，也可用于合成農(nóng)藥精甲霜靈［4－5］。D-纈氨酸作為重要的中間體可用于合成高效殺蟲劑氟胺氰菊酯［6－7］。

轉(zhuǎn)氨酶在合成某些氨基酸及其衍生物領(lǐng)域具有一定應(yīng)用價(jià)值。目前，關(guān)于轉(zhuǎn)氨酶的研究報(bào)道較多的是該酶的酶學(xué)性質(zhì)、催化機(jī)制及抑制動(dòng)力學(xué)研究［8－10］。大腸桿菌纈氨酸轉(zhuǎn)氨酶可以催化L-纈氨酸與丙酮酸反應(yīng)生成α-酮異戊酸和L-丙氨酸。理論上，利用該酶可以把纈氨酸外消旋混合物中的L-纈氨酸轉(zhuǎn)化為α-酮異戊酸，從而實(shí)現(xiàn)外消旋纈氨酸的拆分。目前，關(guān)于纈氨酸轉(zhuǎn)氨酶在氨基酸手性拆分領(lǐng)域的應(yīng)用報(bào)道甚少。本研究利用具有纈氨酸轉(zhuǎn)氨酶活性的工程菌，初步考察了反應(yīng)溫度、pH、底物摩爾比、底物濃度和對(duì)拆分反應(yīng)的影響，進(jìn)而確定酶促反應(yīng)的最佳條件。研究結(jié)果顯示纈氨酸轉(zhuǎn)氨酶具有一定應(yīng)用潛力。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

纈氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因工程菌(pET-32a-avtA)由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。蛋白胨、酵母浸膏、丙酮酸均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，純度≥98%，購自南京基天生物科技有限公司;戊二醛(25%)，天津市津宇精細(xì)化工廠;L-纈氨酸，分析純，湖北新生源生物工程股份有限公司;DL-纈氨酸，純度≥99%，由本實(shí)驗(yàn)室制備;茚三酮，分析純，上?；瘜W(xué)試劑站中心化工廠;其他試劑均為分析純。LB液體培養(yǎng)基組成(1 L體系):蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 5 g，定容前用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0，120℃高壓滅菌備用。

THZ-C恒溫振蕩器(太倉博萊特實(shí)驗(yàn)儀器廠);日立UV-3000型分光光度計(jì)(日本Hitachi公司);日立CR22E型離心機(jī)(日本Hitachi公司);自動(dòng)旋光儀WZZ-2A;P2S電子天平(上海恒平科學(xué)儀器有限公司);RE2002旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海予華儀器有限公司)。

1.2 菌種培養(yǎng)條件

上述纈氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因工程菌平板挑單克隆接種于10 mL含氨芐青霉素50 μg/mL的LB液體培養(yǎng)基，37℃恒溫振蕩培養(yǎng)過夜。次日，過夜培養(yǎng)物接種于2 L含氨芐青霉素50 μg/mL的LB液體培養(yǎng)基，37℃恒溫振蕩(180 r/min)培養(yǎng)6 h，使菌液600 nm光密度大約至0.5。然后冷卻至30℃，加入終濃度為0.4 mmol/L IPTG，在30℃誘導(dǎo)8～10 h。最后離心收集細(xì)胞(5 000 r/min，4℃，15 min)。

1.3 菌體酶活力測(cè)定

稱取0.1 g菌體置于100 mL三角瓶中，加入終濃度為0.2 mol/L DL-纈氨酸和0.1 mol/L丙酮酸溶液10 mL，加入 10% 土溫-80 50 μL，調(diào)節(jié) pH=7，于37℃攪拌反應(yīng)20 min，離心除菌體，收集上清液煮沸5 min滅酶活，冷卻。在以上條件下，纈氨酸轉(zhuǎn)氨酶酶單位定義為每1 min每生成1 μmol的 L-丙氨酸所用的細(xì)胞量。

1.4 底物摩爾比對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響

DL-纈氨酸濃度固定為0.2 mol/L，另一底物丙酮酸濃度分別為 0.1、0.2、0.4、0.8、1.0、1.2 mol/L，即L-纈氨酸與丙酮酸的摩爾比分別為1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶10 和 1∶12。反應(yīng)體積 20 mL，菌體用量 0.2 g，調(diào)節(jié)pH值至9，于45℃下攪拌反應(yīng)18 h。然后取樣測(cè)定樣品中L-丙氨酸含量。轉(zhuǎn)化率定義為:

1.5 底物濃度對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響

DL-纈氨酸終濃度分別為 0.2、0.6、1.0、1.4、1.8 mol/L，丙酮酸終濃度分別為 0.8、2.4、4.0、5.6、7.2 mol/L，即L-纈氨酸與丙酮酸摩爾比為1∶8。反應(yīng)體積30 mL，菌體用量0.6 g，調(diào)節(jié)pH值至9，于45℃下攪拌反應(yīng)48 h。然后取樣測(cè)定L-丙氨酸含量。

1.6 金屬離子對(duì)酶活的影響

在反應(yīng)體系中分別加入終濃度為0.5 mmol/L的Cu2+、Co2+、Fe2+、Mn2+、Mg2+、Na+，測(cè)定酶活力，以不加金屬離子作為對(duì)照。

1.7 丙氨酸含量測(cè)定

反向高效液相色譜(RP-HPLC)測(cè)定樣品中L-丙氨酸的濃度，所用色譜柱為Cosmosil 5C18-AR，20 mm i.d.×250 mm，5 μm流動(dòng)相為0.06%TFA水溶液-乙腈(體積比為98∶2)，流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣量為 10 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對(duì)酶活的影響

溫度對(duì)酶活力的影響見如圖1。纈氨酸轉(zhuǎn)氨酶在45℃時(shí)酶活達(dá)到最大值，可以看出在一定范圍內(nèi)，隨著溫度升高，酶活性逐漸增大;相對(duì)酶活達(dá)到最大值后，隨著溫度的進(jìn)一步升高，酶活反而減小。

圖1 溫度對(duì)酶活力的影響Fig.1 Effect of temperature on enzyme activity

2.2 pH值對(duì)酶活的影響

酶活隨pH值的變化規(guī)律如圖2所示。在一定pH值范圍內(nèi)，酶活隨著pH值的升高而相應(yīng)的升高;當(dāng)酶活性升高到最大值后隨著pH值的進(jìn)一步升高，酶活性開始降低;菌體的最適pH在pH=9附近。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果還可以看出，該酶的最適pH值比生物體內(nèi)天然pH值高，其原因是轉(zhuǎn)氨反應(yīng)屬于加成反應(yīng)，其反應(yīng)機(jī)理是由供體氨基氮原子的孤對(duì)電子進(jìn)攻受體酮酸羰基碳原子，在酶的作用下，形成反應(yīng)中間體，然后生成產(chǎn)物。較高的pH值可以使供體氨基氮原子更多處于自由態(tài)，而不是結(jié)合H+離子，這樣更有利于氮原子進(jìn)攻羰基碳原子發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。

圖2 pH對(duì)酶活力的影響Fig.2 Effect of pH on enzyme activity

2.3 底物摩爾比對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響

在酶催化的多底物生化反應(yīng)中，增加其中一種底物的相對(duì)濃度常常可以促進(jìn)另一種底物的轉(zhuǎn)化。從圖3可以看出，隨著底物L(fēng)-纈氨酸與丙酮酸的摩爾比逐漸增大，轉(zhuǎn)化率也同時(shí)增大;當(dāng)?shù)孜風(fēng)-纈氨酸與丙酮酸的摩爾比增加到1∶8時(shí)，轉(zhuǎn)化率達(dá)到最大值98.7%;之后，隨著摩爾比的進(jìn)一步增加，轉(zhuǎn)化率趨于穩(wěn)定。因此，選擇L-纈氨酸與丙酮酸摩爾比1∶8為最佳底物比例。

圖3 底物摩爾比對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響Fig.3 Effect of substrate mole ratio on enzyme activity

2.4 底物濃度對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響

從圖4可以看出，隨著底物濃度的增加轉(zhuǎn)化率有降低的趨勢(shì)。當(dāng)L-纈氨酸底物濃度為0.1 mol/L和0.3 mol/L時(shí)，轉(zhuǎn)化率最分別是98.6%和98.3%;當(dāng)L-纈氨酸濃度進(jìn)一步升高時(shí)，轉(zhuǎn)化率明顯降低。高底物濃度條件下轉(zhuǎn)化率降低的原因可能是高濃度產(chǎn)物對(duì)催化反應(yīng)的抑制。因此，為了充分發(fā)揮酶的催化效率，實(shí)際應(yīng)用中以DL-纈氨酸為0.6 mol/L和丙酮酸濃度為2.4 mol/L作為最適底物濃度。

圖4 底物濃度對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響Fig.4 Effect of substrate concentration on enzyme activity

2.5 金屬離子對(duì)酶活的影響

金屬離子可以影響酶解底物絡(luò)合物的形成，以及改變和影響酶的催化活性。從圖5可以看出，金屬離子對(duì)纈氨酸轉(zhuǎn)氨酶活性影響比較明顯，Cu2+、Co2+、Fe2+、Mn2+對(duì)酶活性有抑制作用，而 Mg2+、Na+對(duì)酶活性有一定的激活作用。

圖5 金屬離子對(duì)酶活的影響Fig.5 Effect of metal ion on enzyme activity

3 結(jié)論

目前制備D-氨基酸的方法主要有生物酶法、不對(duì)稱化學(xué)合成法和光學(xué)拆分法［11］。不對(duì)稱合成法需要純手性試劑或貴金屬絡(luò)合物作催化劑，該法成本高不適合大規(guī)模制備。光學(xué)拆分法(或非對(duì)映體鹽法)需要篩選合適的化學(xué)拆分劑，該法應(yīng)用領(lǐng)域有限也不適合大量制備。生物酶法制備D-氨基酸由于具有經(jīng)濟(jì)、高效、環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)逐漸成為國內(nèi)外研究熱點(diǎn)［12］。本研究利用大腸桿菌纈氨酸轉(zhuǎn)氨酶把纈氨酸外消旋混合物中的L-纈氨酸轉(zhuǎn)化為α-酮異戊酸，從而實(shí)現(xiàn)外消旋纈氨酸的拆分。實(shí)驗(yàn)中考察了反應(yīng)溫度、pH值、底物摩爾比、底物濃度和金屬離子對(duì)拆分反應(yīng)的影響，進(jìn)而確定酶促反應(yīng)的最佳條件。結(jié)果表明，該催化反應(yīng)的最適反應(yīng)條件為:反應(yīng)溫度是45℃，pH=9，L-纈氨酸與丙酮酸的摩爾比 1∶8，DL-纈氨酸初始濃度為0.6 mol/L和丙酮酸初始濃度為2.4 mol/L，0.5 mmol/L的Mg2+和Na+對(duì)酶活性有明顯的促進(jìn)作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)于轉(zhuǎn)氨酶的進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用有參考價(jià)值。

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