于雷雷，王超，施波，馬妙蓮，段慧，張明

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽合肥，230036)

細(xì)菌素(bacteriocin)是一些細(xì)菌產(chǎn)生的抗菌多肽或蛋白［1］，因其能被人類胃腸道分泌的蛋白酶降解，對(duì)人體無毒副作用，所以具有作為食品生物防腐劑的潛在應(yīng)用價(jià)值，乳酸乳球菌素nisin在乳制品及罐頭制品中已得到了廣泛的應(yīng)用［2］。戊糖乳桿菌 (Lactobacillus pentosus)［3］是公認(rèn)的食品安全菌，因而對(duì)戊糖乳桿菌細(xì)菌素戊糖乳桿菌素進(jìn)行了大量研究，有關(guān)戊糖乳桿菌素的報(bào)道最早見于1999年有關(guān)pentocin TV35b的分離純化［4］，我國(guó)在2004年首次報(bào)道了pentocin 31－1的分離純化［5－9］。已報(bào)道的產(chǎn)細(xì)菌素戊糖乳桿菌有 L.pentosus TV35b［4］、L.pentosus 31 －1［5－9］、L.pentosus ST151BR［10］、L.pentosus B96［11］、L.pentosus ST712BZ［12］、L.pentosus S-PT84［13］、L.pentosus b240［14］、L.pentosus IG1［15］、L.pentosus［16］、L.pentosus C50-6［3］、L. pentosus 191 和 L. pentosus 204［17］等。

戊糖乳桿菌素多屬于II類細(xì)菌素，分子量較小、熱穩(wěn)定性高、主要抑制革蘭氏陽性菌［4］，但pentocin C50-6還能抑制革蘭氏陰性菌［3］，在N-末端具有 IIa類細(xì)菌素的保守序列YGNGV，對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)ATCC19115有較強(qiáng)的抑制作用［5］。L.pentosus B96和L.pentosus IG1所產(chǎn)的IIb類細(xì)菌素均由2個(gè)高度疏水、對(duì)熱穩(wěn)定的小分子肽組成，2個(gè)組分在抑菌功能上具有協(xié)同作用［11，15］。Pentocin C50-6 由于沒有進(jìn)行序列測(cè)定，僅根據(jù)分子量和抑菌譜的分析推測(cè)其可能屬于抑菌譜較廣的I類或II類細(xì)菌素［3］，暫未發(fā)現(xiàn)屬于IIc類、IId類、III類和IV類的戊糖乳桿菌素。細(xì)菌素的抑菌方式一般分為抑菌、殺菌不溶菌和殺菌且溶菌3種類型，研究表明現(xiàn)已報(bào)道的pentocin TV35b和pentocin 31-1對(duì)指示菌的的作用方式均為殺菌不溶菌［4－5］。戊糖乳桿菌素由于可耐受高溫處理，且大部分在酸性或弱堿性條件下穩(wěn)定［2－9］，因而在食品領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。本文主要探討了戊糖乳桿菌LPEM818細(xì)菌素的生物學(xué)特性以及對(duì)指示菌的作用方式等，以待為該細(xì)菌素的應(yīng)用和進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株

產(chǎn)細(xì)菌素菌株:戊糖乳桿菌(Lactobacillus pentosus)LPEM818為安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室篩選保藏;指示菌株見表2。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基和 LB培養(yǎng)基［18］。

1.1.3 主要藥品試劑

胃蛋白酶(BBI)，木瓜蛋白酶(Sangon)，脂肪酶(Sigma)，過氧化氫酶(Sigma)，凝乳蛋白酶(BBI)，胰蛋白酶(BBI)，蛋白酶K(Sigma)，Sephadex G-25(GE Healthcare)，BSA(BBI)，F(xiàn)olin-酚試劑(Sangon)，尿素(BBI)，EDTA(BBI)，SDS(BBI)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 Pentocin LPEM818的活性及效價(jià)的測(cè)定

采用牛津杯雙層平板法［19］和雙層平板二倍稀釋法［20］。

1.2.2 蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定

Lowry 法［21］。

1.2.3 Pentocin LPEM818 的初步純化［22］

接種6環(huán)菌株LPEM818于MRS培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)14 h作為種子液。按4%的體積比將種子液接種于4 L MRS培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h。將發(fā)酵液離心，過濾(0.45 μm)，上清液進(jìn)行80% 硫酸銨沉淀，4℃過夜，離心取沉淀，重懸于 ddH2O中，用透析袋(500 u)透析脫鹽，經(jīng)氯化鋇檢測(cè)不含硫酸銨，收集透析液，測(cè)定其效價(jià)并冷凍干燥，得到 pentocin LPEM818干粉。將pentocin LPEM818干粉重懸于ddH2O，得到效價(jià)為1 060AU/mL的樣品，取5 mL上Sephadex G-25(1.6 cm×100 cm)凝膠層析，流速為0.6 mL/min，流動(dòng)相為ddH2O。收集各峰進(jìn)行活性檢測(cè)，確定其活性峰。

1.2.4 Pentocin LPEM818的生物學(xué)特性研究

1.2.4.1 pH值和熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

樣品用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH分別調(diào)pH值至 2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 和 12.0，補(bǔ)加 ddH2O 使樣品終體積相等，以ddH2O同比稀釋的樣品作為對(duì)照，每組設(shè)3個(gè)平行，37℃水浴6 h后，調(diào) pH值至5.0，檢測(cè)其抑菌活性。

樣品分別進(jìn)行 4、37、60、80、100 和 121℃水浴 15 min或30 min，以未經(jīng)處理的樣品為對(duì)照，每組設(shè)3個(gè)平行，冰浴10 min后檢測(cè)其抑菌活性。

1.2.4.2 酶和有機(jī)溶劑敏感性實(shí)驗(yàn)

樣品用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH分別調(diào)至各酶最適pH值，使各酶的最終濃度為5 mg/mL，以ddH2O同比稀釋的酶和同比稀釋的樣品分別作為對(duì)照，每組設(shè)3個(gè)平行，37℃水浴8h，沸水浴10 min，檢測(cè)抑菌活性。

樣品分別加入1%體積比的 SDS、尿素、NaCl、EDTA、Triton X-100、吐溫-80和乙腈，以 ddH2O 同比稀釋的有機(jī)溶劑和同比稀釋的樣品分別作為對(duì)照，每組設(shè)3個(gè)平行，37℃水浴4h，檢測(cè)抑菌活性。

1.2.4.3 抑菌譜的測(cè)定

采用牛津杯雙層平板法，分別對(duì)供試G+菌株和G－菌株做抑菌實(shí)驗(yàn)。

1.2.4.4 作用方式的測(cè)定

將菌株533接種于LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)14 h(OD600=2.89)作為種子液，按4%的體積比接種于LB培養(yǎng)基，分成兩組，一組在8h后加入 pentocin LPEM818樣品，另一組加等體積的無菌生理鹽水作為對(duì)照，37℃培養(yǎng)26 h，每2 h取出5 mL，測(cè)定OD600，計(jì)算菌落數(shù)(CFU/mL)，每次測(cè)3個(gè)平行。

1.2.4.5 生理曲線的測(cè)定

將菌株LPEM818的種子液按4%的體積比接種于MRS培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)。每隔2 h取樣，測(cè)定OD600，pH值和上清液抑菌活性，各設(shè)3個(gè)平行。

2 結(jié)果與分析

2.1 Pentocin LPEM818的初步純化

為了對(duì)pentocin LPEM818進(jìn)行初步純化，本實(shí)驗(yàn)以80%硫酸銨沉淀樣品為材料，進(jìn)行了Sephadex G-25(1.6 cm×100 cm)凝膠層析分析(圖1)。上樣量為5 mL，流速為0.6 mL/min，流動(dòng)相為 ddH2O，收集各峰并測(cè)定活性。

圖1 Sephadex G-25層析圖譜Fig.1 The chromatogram of G-25

經(jīng)G-25凝膠層析后，樣品有2個(gè)峰(圖1)，抑菌實(shí)驗(yàn)證實(shí)第2個(gè)峰為活性峰，而第1個(gè)峰無抑菌活性，為雜蛋白峰，達(dá)到了一定的分離效果。說明硫酸銨沉淀分離法用于初步分離該細(xì)菌素是可行的。經(jīng)過硫酸銨沉淀和G-25層析分離純化后，該細(xì)菌素的純化倍數(shù)為11.09倍，回收率為6.4%(表1)。經(jīng)Tricine-SDS-PAGE電泳后，出現(xiàn)多條蛋白質(zhì)條帶(結(jié)果未顯示)，分子質(zhì)量在6.5～27 ku，說明該細(xì)菌素為小分子肽。可能由于樣品上樣量太少，導(dǎo)致未檢測(cè)到有抑菌活性的條帶;要獲取單一條帶，有待進(jìn)一步優(yōu)化分離純化條件。

2.2 Pentocin LPEM818的pH值和熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

對(duì)80%硫酸銨沉淀樣品分別在不同的pH值條件下，37℃水浴6 h后，調(diào)pH值至5.0，檢測(cè)抑菌活性，以獲得該細(xì)菌素的pH穩(wěn)定性范圍。相同樣品經(jīng)不同的溫度處理15 min或30 min，冰浴10 min，檢測(cè)抑菌活性，以獲得該細(xì)菌素的熱穩(wěn)定性范圍。

表1 Pentocin LPEM818的純化表Table 1 Purification table for pentocin LPEM818

pH穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖2)表明，樣品在pH 4.0～6.0條件下抑菌活性最高，其保留值約為90%，在pH 2.0和8.0條件下抑菌活性仍保留在80%，當(dāng)pH在10.0或12.0時(shí)抑菌活性完全喪失。因此，該細(xì)菌素具有較好的酸和弱堿穩(wěn)定性。熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖3)表明，樣品經(jīng)4～80℃處理后，抑菌活性保留在90%以上。經(jīng)100℃處理30 min和121℃處理15 min后，抑菌活性保留在80%以上，而經(jīng)121℃處理30 min后，其抑菌活性仍保留在66.98%。因此該細(xì)菌素是一種熱穩(wěn)定型的細(xì)菌素。

圖2 不同pH對(duì)樣品抑菌活性的影響Fig.2 The antibacterial activity of sampleat the different pH

圖3 不同溫度對(duì)樣品抑菌活性的影響Fig.3 The antibacterial activity of sample at the different temperature

2.3 Pentocin LPEM818對(duì)酶和有機(jī)溶劑的敏感性實(shí)驗(yàn)

對(duì)80%硫酸銨沉淀樣品分別經(jīng)不同的酶在37℃條件下處理8 h，沸水浴10 min，檢測(cè)抑菌活性，以確定該細(xì)菌素的酶敏感性。相同樣品經(jīng)不同的有機(jī)溶劑在37℃條件下處理4 h，檢測(cè)其抑菌活性，以確定該細(xì)菌素的有機(jī)溶劑敏感性。

對(duì)酶敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖4)表明，樣品經(jīng)蛋白酶K和胰蛋白酶處理后抑菌活性完全喪失，所以對(duì)其敏感;樣品經(jīng)凝乳蛋白酶處理后抑菌活性下降15%，所以對(duì)其較敏感;樣品經(jīng)脂蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶處理后抑菌活性基本不變，所以對(duì)其不敏感，因此該細(xì)菌素為蛋白類抑菌物質(zhì)。對(duì)有機(jī)溶劑敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖5)表明，樣品經(jīng)尿素處理后抑菌活性下降14%，所以對(duì)其較敏感;樣品經(jīng) Triton X-100、NaCl、吐溫-80和乙腈處理后抑菌活性不變，所以對(duì)其不敏感;該細(xì)菌素與SDS或EDTA共同作用時(shí)，抑菌效果明顯好于單一作用，因此二者具有協(xié)同抑菌作用。

圖4 不同酶對(duì)樣品抑菌活性的影響Fig.4 The antibacterial activity of sample at the different enzymes

圖5 不同有機(jī)溶劑對(duì)樣品抑菌活性的影響Fig.5 The antibacterial activity of sample at the different organic solvent

2.4 Pentocin LPEM818抑菌譜的測(cè)定

用80%硫酸銨沉淀樣品分別對(duì)供試的G+菌株和G－菌株做抑菌實(shí)驗(yàn)(表2)，測(cè)定抑菌圈直徑，以確定該細(xì)菌素抑菌譜。

表2 Pentocin LPEM818的抑菌譜Table 2 Antibacterial spectrum of pentocin LPEM818

硫酸銨沉淀樣品的抑菌譜測(cè)定結(jié)果(表2)表明，pentocin LPEM818對(duì)供試的G－菌株變形桿菌、雞白痢沙門氏菌、綠膿桿菌和G+菌株單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌、四聯(lián)球菌的抑制作用明顯;對(duì)糞腸球菌、發(fā)酵乳桿菌、保加利亞乳桿菌、短乳桿菌等近源乳酸菌也有較好的抑制作用。

2.5 作用方式的測(cè)定

圖6 Pentocin LPEM818對(duì)S.pullorum533的作用方式Fig.6 The effect of pentocin LPEM818 on the growth of S.pullorum 533

將接種過菌株533的LB培養(yǎng)基置于37℃培養(yǎng)，每隔2 h取樣，測(cè)定其OD600值，監(jiān)測(cè)菌體濃度的變化，同時(shí)測(cè)定CFU監(jiān)測(cè)活菌數(shù)量，獲得菌體的生長(zhǎng)情況(圖6)，以確定該細(xì)菌素對(duì)指示菌的作用方式。

對(duì)菌株533作用方式的研究(圖6)表明，菌體在12 h后進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期。實(shí)驗(yàn)組菌株533的活菌數(shù)在10 h，從1×108降至1×107，隨后趨勢(shì)略有下降。說明細(xì)菌素在短時(shí)間內(nèi)殺死了大量指示菌，該細(xì)菌素對(duì)指示菌的作用方式為殺菌。而對(duì)照組活菌數(shù)則呈持續(xù)上升趨勢(shì)，10h后保持穩(wěn)定;實(shí)驗(yàn)組菌株533的OD600在10 h后基本保持恒定，說明該細(xì)菌素對(duì)指示菌無溶菌現(xiàn)象;而對(duì)照組OD600一直呈上升趨勢(shì)，直至16 h后穩(wěn)定。因此，該細(xì)菌素對(duì)指示菌的作用方式僅為殺菌。

2.6 生理曲線的測(cè)定

將接種過菌株 LPEM818的 MRS培養(yǎng)基置于37℃培養(yǎng)，每隔2 h取樣，測(cè)定OD600值，pH值和上清液抑菌活性，以測(cè)定該菌株的生理曲線。

菌株LPEM818生理曲線的測(cè)定結(jié)果(圖7)表明，菌株LPEM818置于37℃培養(yǎng)，6 h進(jìn)入對(duì)數(shù)中期，16 h進(jìn)入穩(wěn)定期，此時(shí)OD600值最大，22 h進(jìn)入衰亡期。發(fā)酵上清液的pH值從6.24降至4.50，18 h后保持恒定。在對(duì)數(shù)期中期開始產(chǎn)生細(xì)菌素，且在穩(wěn)定期后期產(chǎn)量達(dá)到最大值，此時(shí)抑菌活性達(dá)到最高，隨后保持穩(wěn)定，整個(gè)過程受pH的影響較小。

圖7 L.pentosus LPEM818的生理曲線Fig.7 Production of pentocin LPEM818 during growth of L.pentosus LPEM818

3 討論與結(jié)論

3.1 Pentocin LPEM818的初步純化

細(xì)菌素的分離純化與其特性研究密切相關(guān)。細(xì)菌素的初步分離方法有鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法和pH吸附法等，進(jìn)一步純化方法有凝膠過濾層析、離子交換層析、疏水相互作用層析和反相高效液相色譜等。本研究采用硫酸銨沉淀和Sephadex G-25凝膠層析對(duì)pentocin LPEM818進(jìn)行了初步純化，最終純化倍數(shù)為11.09倍，但回收率僅為6.4%，說明純化過程中目的蛋白損失較大。今后應(yīng)繼續(xù)對(duì)pentocin LPEM818的分離純化條件進(jìn)行優(yōu)化，為將來的精細(xì)純化及應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，但是根據(jù)其目的蛋白峰，確定了硫酸銨沉淀法樣品用于生物學(xué)特性研究的可行性。

3.2 Pentocin LPEM818的作用方式

細(xì)菌素通常對(duì)敏感菌株的作用方式表現(xiàn)為3種類型:抑菌、殺菌不溶菌和殺菌且溶菌。本研究在S.pullorum 533的菌懸液中加入80%硫酸銨沉淀樣品后，在短時(shí)間內(nèi)對(duì)S.pullorum 533的活菌數(shù)產(chǎn)生了有效的抑制作用，并且在加入該細(xì)菌素后OD600無明顯變化，因此該細(xì)菌素對(duì)S.pullorum 533的作用方式僅為殺菌。具有與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同作用方式的細(xì)菌素有 bacTN635［23］和 plantaricin MG［24］，其中 bacTN635的指示菌活菌數(shù)下降了6個(gè)單位，而OD600無明顯變化;plantaricin MG的指示菌活菌數(shù)下降了96.3%，而OD600也無明顯變化。而 plantaricin TF711［25］的指示菌活菌數(shù)在3h內(nèi)下降了1.3個(gè)單位，隨后有所上升，9h后保持穩(wěn)定，其作用方式為抑菌。所以pentocin LPEM818比bacTN635或plantaricin MG的抑菌效果稍差，但優(yōu)于plantaricin TF711。

3.3 Pentocin LPEM818的生物學(xué)特性

細(xì)菌素的生物學(xué)特性決定其潛在的應(yīng)用價(jià)值。Pentocin LPEM818在pH 2.0～8.0條件下穩(wěn)定，具有酸和弱堿穩(wěn)定性的特點(diǎn)，與enterocin LR/6在pH 2.0－8.0條件下抑菌活性保留80%［26］基本相同，但其熱穩(wěn)定性不及pentocin LPEM818。Pentocin LPEM818在121℃處理30 min仍保留67%的抑菌活性，具有較好的熱穩(wěn)定性。具有相似特性的pentocin 31－1在100℃處理 15 min只保留 50%的抑菌活性［7］。pentocin LPEM818熱穩(wěn)定性明顯優(yōu)于pentocin 31－1。pentocin LPEM818對(duì)酶的敏感性的特點(diǎn)與Pediococcus pentosaceus CFR SIII所產(chǎn)的細(xì)菌素相似，僅對(duì)胰蛋白酶和蛋白酶K敏感［27］，但其pH穩(wěn)定性范圍為3.0～5.0明顯差于本細(xì)菌素。對(duì)吐溫-80、NaCl、乙腈和 Triton X-100不敏感，對(duì)尿素敏感的特點(diǎn)與sakacin LSJ618［28］相一致，進(jìn)一步表明了該細(xì)菌素具有蛋白屬性。EDTA或 SDS本身對(duì)S.pullorum 533具有抑制作用，pentocin LPEM818與SDS或EDTA共同作用時(shí)，抑菌效果明顯好于單一作用，因此二者有協(xié)同抑菌作用［28－30］。在實(shí)驗(yàn)條件下，菌株 LPEM818在對(duì)數(shù)中期開始產(chǎn)生細(xì)菌素，在穩(wěn)定期后期產(chǎn)量達(dá)到最大值，隨后保持穩(wěn)定，產(chǎn)細(xì)菌素過程受環(huán)境pH的影響較小。該細(xì)菌素對(duì)供試的大部分G+菌株和G－菌株均具有較強(qiáng)抑制作用，其抑菌譜廣，對(duì)多數(shù)致病菌和食品腐敗菌抑菌作用明顯，特別是對(duì)Listeria monocytogenes ATCC19115和G－菌株較強(qiáng)的抑制作用，所以其具有作為食品生物防腐劑的潛在應(yīng)用價(jià)值。

［1］ 郭興華.益生乳酸細(xì)菌:分子生物學(xué)及生物技術(shù)［M］.北京:科學(xué)出版社，2008.

［2］ 呂燕妮，李平蘭，孫成虎，等.戊糖乳桿菌31－1菌株所產(chǎn)細(xì)菌素的理化及生物學(xué)特性［J］.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，11(1):39－43.

［3］ 劉書亮，敖靈，周佳，等.戊糖乳桿菌素 C50－6的純化及特性研究［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2010，36(5):36－40.

［4］ Okkers D J，Dicks L M，Silvester M，et al.Characterization of pentocin TV35b，a bacteriocin-like peptide isolated from Lactobacillus pentosus with a fungistatic effect on Candida albicans［J］.Journal of Applied Microbiology，1999，87(5):726－734.

［5］ Zhang J，Liu G，Shang N，et al.Purification and partial amino acid sequence of pentocin 31-1，an anti-listeria bacteriocin produced by Lactobacillus pentosus 31-1［J］.Journal of Food Protection，2009，72(12):2 524－2 529.

［6］ Liu G R，Griffiths M W，Shang N，et al.Applicability of bacteriocinogenic Lactobacillus pentosus 31-1 as a novel functional starter culture or coculture for fermented sausage manufacture［J］.Journal of Food Protection，2010，73(2):292－298.

［7］ Liu G R，Lv Y，Li P L，et al.Pentocin 31-1，an anti-Listeria bacteriocin produced by Lactobacillus pentosus 31-1 isolated from Xuan-Wei Ham，a traditional China fermented meat product［J］.Food Control，2008，19(4):353 －359.

［8］ Zhang J L，Liu G R，Li P L，et al.Pentocin 31-1，a novel meat-borne bacteriocin and its application as biopreservative in chill-stored tray-packaged pork meat［J］.Food Control，2010，21(2):198 －202.

［9］ Zhou K，Zhou W，Li P，et al.Mode of action of pentocin 31-1:An antilisteria bacteriocin produced by Lactobacillus pentosus from Chinese traditional ham［J］.Food Control，2008，19(8):817－822.

［10］ Todorov S D，Dicks L M T.Effect of medium components on bacteriocin production by Lactobacillus pentosus ST151BR，a strain isolated from beer produced by the fermentation of maize，barley and soy flour［J］.World Journal of Microbiology＆ Biotechnology，2004，20(6):643－650.

［11］ Delgado A，Brito D，Peres C，et al.Bacteriocin production by Lactobacillus pentosus B96 can be expressed as a function of temperature and NaCl concentration［J］.Food Microbiol，2005，22(6):521 －528.

［12］ Todorov S D，Dicks L M T.Bacteriocin production by Lactobacillus pentosus ST712BZ isolated from boza［J］.Brazilian Journal of Microbiology，2007，38(1):166 －172.

［13］ Izumo T，Izumi F，Nakagawa I，et al.Influence of Lactobacillus pentosus S-PT84 ingestion on the mucosal immunity of healthy and salmonella typhimurium-infected mice［J］.Bioscience and Microflora，2011，30(2):27－35.

［14］ Kotani Y，Shinkai S，Okamatsu H，et al.Oral intake of Lactobacillus pentosus strain b240 accelerates salivary immunoglobulin A secretion in the elderly:A randomized，placebo-controlled，double-blind trial［J］.Immunity and Ageing，2010(7):11.

［15］ Maldonado-Barragan A，Caballero-Guerrero B，Lucena-Padros H，et al.Genome sequence of Lactobacillus pentosus IG1，a strain isolated from Spanish-style green olive fermentations［J］.Journal of Bacteriology，2011，193(19):5 605.

［16］ Nieto-Lozano J，Reguera-Useros J，Pelaez-Martinez M，et al.Bacteriocinogenic activity from starter cultures used in Spanish meat industry［J］.Meat Science，2002，62(2):237－243.

［17］ Con A H，Gokalp H Y.Production of bacteriocin-like metabolites by lactic acid cultures isolated from sucuk samples［J］.Meat Science，2000，55(1):89 －96.

［18］ 張剛.乳酸細(xì)菌:基礎(chǔ)，技術(shù)和應(yīng)用［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2007.

［19］ 張艾青，劉書亮，敖靈.產(chǎn)廣譜細(xì)菌素乳酸菌的篩選和鑒定［J］.微生物學(xué)通報(bào)，2007，34(4):753－756.

［20］ 方佳琪，竺德強(qiáng)，柯芳芳，等.pH吸附法純化乳酸乳球菌素 Lacticin LLC518［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2011，37(10):52－56.

［21］ 汪家政，范明.蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè)［M］.北京:科學(xué)出版社，2000:42－91.

［22］ Todorov S D，Rachman C，F(xiàn)ourrier A，et al.Characterization of a bacteriocin produced by Lactobacillus sakei R1333 isolated from smoked salmon［J］.Anaerobe，2011，17(1):23－31.

［23］ Smaoui S，Elleuch L，Bejar W，et al.Inhibition of fungi and gram-negative bacteria by bacteriocin BacTN635 produced by Lactobacillus plantarum sp.TN635［J］.Applied Biochemistry and Biotechnology，2010，162(4):1 132－1 146.

［24］ Gong H S，Meng X C，Wang H.Plantaricin MG active against Gram-negative bacteria produced by Lactobacillus plantarum KLDS1.0391 isolated from“Jiaoke”，a traditional fermented cream from China［J］.Food Control，2010，21(1):89－96.

［25］ Hernandez D，Cardell E，Zarate V.Antimicrobial activity of lactic acid bacteria isolated from Tenerife cheese:ini-tial characterization of plantaricin TF711，a bacteriocinlike substance produced by Lactobacillus plantarum TF711［J］.Journal of Applied Microbiology，2005，99(1):77－84.

［26］ Kumar M，Tiwari S K，Srivastava S.Purification and characterization of enterocin LR/6，a bacteriocin from Enterococcus faecium LR/6［J］.Applied Biochemistry and Biotechnology，2010，160(1):40－49.

［27］ Halami P M，Badarinath V，Manjulata Devi S，et al.Partial characterization of heat-stable，antilisterial and cell lytic bacteriocin of Pediococcus pentosaceus CFR SIII isolated from a vegetable source［J］.Annals of Microbiology，2011，61:1－8.

［28］ Jiang J，Shi B，Zhu D，et al.Characterization of a novel bacteriocin produced by Lactobacillus sakei LSJ618 isolated from traditional Chinese fermented radish［J］.Food Control，2012，23(2):338 －344.

［29］ Kopermsub P，Mayen V，Warin C.Potential use of niosomes for encapsulation of nisin and EDTA and their antibacterial activity enhancement［J］.Food Research International，2011，44(2):605－612.

［30］ Parente E，Giglio M A，Ricciardi A，et al.The combined effect of nisin，leucocin F10，pH，NaCl and EDTA on the survival of Listeria monocytogenes in broth［J］.International Journal of Food Microbiology，1998，40:65－75.