武陽陽，虞泓，葛鋒，陳自宏，曾文波

1(昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明，650500)2(云南大學(xué)中草藥生物資源研究所云百草實(shí)驗(yàn)室，云南昆明，650091)

三七［Panax notoginseng(Burk)F.H.Chen］為五加科人參屬多年生草本植物，是我國(guó)傳統(tǒng)的藥用植物［1］。三 七 總 皂 苷 (panax notoginseng saponins，PNS)是三七的主要有效成分，在耐缺氧、抗衰老和提高機(jī)體免疫力等方面的藥理作用顯著，且總皂苷和部分單體皂苷在血液系統(tǒng)、心腦血管系統(tǒng)以及抗炎、抗腫瘤等方面均有較好活性［2］。研究表明，植物中天然的人參皂苷含量低，且分子結(jié)構(gòu)不是最佳的活性狀態(tài)，通過生物轉(zhuǎn)化減少皂苷結(jié)構(gòu)中的糖基數(shù)目，可將天然皂苷中含量較高的Rg1、Rb1、Rb2、Re轉(zhuǎn)化為稀有皂苷(如Rd、Rh1、C-K等)，可提高其療效和生理活性［3－6］。稀有人參皂苷在治療心腦血管疾病、抗腫瘤方面表現(xiàn)出較好的藥理活性，如人參皂苷Rd可以促進(jìn)T細(xì)胞的增殖，提高天然殺傷細(xì)胞的活性，對(duì)心腦血管、神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)等作用獨(dú)特，可提高機(jī)體的免疫力，有可能成為治療腦卒中的新型臨床治療藥物，是一種很有前景的候選藥物［7－8］。但人參皂苷Rd在植物內(nèi)的含量很低，且結(jié)構(gòu)復(fù)雜，難以化學(xué)合成［9］。因此，獲得大量高純度的人參皂苷Rd具有重大的科研意義和應(yīng)用價(jià)值。稀有皂苷可通過生物轉(zhuǎn)化法獲得，因其效率高、無污染，具有較好的應(yīng)用前景。

目前，微生物發(fā)酵三七在國(guó)內(nèi)外已經(jīng)得到了極大的關(guān)注與發(fā)展。大型藥食兼用菌與西洋參進(jìn)行共培養(yǎng)，可將人參皂苷Rb1等轉(zhuǎn)化為Rd和C-K，得到稀有皂苷［10］。李國(guó)紅等采用枯草芽抱桿菌對(duì)三七根進(jìn)行發(fā)酵，從發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到新的人參皂苷RH4［11］。采用莫勒接霉(Zygorhynchus moelleri)和灰綠犁頭霉(Absidia glauca)可將Rb1專一的轉(zhuǎn)化為Rd［12］。擬青霉 (Paecilomyces bainier sp.229)可將Rb1大量轉(zhuǎn)化為 Rd，進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為 C-K［13］。

冬蟲夏草是我國(guó)名貴的藥食用真菌，其主要活性成分有蟲草素、甘露醇、腺苷及微量元素等，具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗炎癥、降血糖和延緩衰老等多方面的作用［14－16］，但天然的冬蟲夏草目前已瀕臨滅絕。從冬蟲夏草中分離出的蝙蝠蛾擬青霉、蛹蟲草分離出的蛹草擬青霉和蟬花中分離出的蟬擬青霉，通過人工培養(yǎng)獲得的菌絲體在功效成分、藥理作用以及臨床療效方面與冬蟲夏草相似，為藥食兩用真菌［17］。目前，在蟲草菌種的培養(yǎng)條件優(yōu)化及其菌絲體功效成分的檢測(cè)和藥理作用方面已有不少的研究，但有關(guān)與三七共培養(yǎng)的研究還鮮見報(bào)道。本研究采用蝙蝠蛾擬青霉、蛹草擬青霉和蟬擬青霉分別固體發(fā)酵三七，旨在探討蟲草真菌這一重要微生物是否能轉(zhuǎn)化三七中的皂苷成分，以期利用藥食兼用蟲草真菌發(fā)酵三七獲得稀有皂苷，并合成腺苷、蟲草素和甘露醇等蟲草的功效成分，實(shí)現(xiàn)一次發(fā)酵過程同時(shí)獲得蟲草和三七的藥用成分。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

菌株蝙蝠蛾擬青霉 PHEP-2、蛹草擬青霉PMILSM5和蟬擬青霉PCICYL1-3，均保存于云南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院云百草實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 試劑

三七皂苷R1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb1，購于中國(guó)藥品生物制品檢定所;人參皂苷Rh1、人參皂苷Rg1、人參皂苷 Rd、人參皂苷 F1、人參皂苷 F2、人參皂苷Rg3和人參皂苷C-K，購于南方標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)網(wǎng);乙腈、甲醇均為色譜純，其余試劑均為分析純。

1.1.3 儀器

高效液相色譜儀(戴安ULTIMATE 3000 LPG-3400A四元梯度泵，WPS-3000SL自動(dòng)進(jìn)樣器，PDA-3000二極管陣列檢測(cè)器，TCC-3000柱溫箱，美國(guó)戴安儀器公司);Waters Symmetry C18色譜柱(250 mm×4.6 μm，5 μm，100A，美國(guó) Waters 公司);紫外可見分光光度計(jì)(T6系列，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司);DHG-9203A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基

(1)斜面培養(yǎng)基:洋芋粉20 g/L，蔗糖20 g/L，瓊脂18 g/L，蛋白胨 10 g/L，自然 pH，121℃滅菌 30 min。

(2)種子培養(yǎng)基:葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母粉10 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO40.5 g/L。自然pH，121℃滅菌30 min。

(3)發(fā)酵培養(yǎng)基:精確稱取5 g過60目篩的三七粉于100 mL三角瓶，加入0.1 mL無機(jī)鹽(10 g/L KH2PO4，5 g/L MgSO4)，加入去離子水，使最終培養(yǎng)基中基質(zhì)含水量為60%。自然 pH，121℃滅菌30 min。

1.2.2 培養(yǎng)方法

(1)將菌株蝙蝠蛾擬青霉、蛹草擬青霉和蟬擬青霉分別接入斜面培養(yǎng)基中，于26℃恒溫培養(yǎng)培養(yǎng)5 d。

(2)將已培養(yǎng)好的斜面菌種接入種子培養(yǎng)基中，于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中26℃、150 r/min條件下培養(yǎng)5 d，備用。

(3)將發(fā)酵好的種子液以5%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，于恒溫培養(yǎng)箱中26℃，至菌絲長(zhǎng)滿培養(yǎng)基即成固體發(fā)酵物。以滅菌后的原藥材為空白對(duì)照。

1.2.3 發(fā)酵產(chǎn)物的檢測(cè)

1.2.3.1 發(fā)酵產(chǎn)物皂苷的HPLC測(cè)定

至菌絲長(zhǎng)滿培養(yǎng)基將發(fā)酵產(chǎn)物烘干，粉碎。取0.1 g，3 mL 70%甲醇溶解，0.45 μm 微孔濾膜過濾，上柱檢測(cè)。

色譜流動(dòng)相:乙腈-水梯度洗脫(0～30 min，20∶80;30～60 min，20～45:80～55;60～78 min，45～75:55 ～25;78 ～80 min，75 ～100∶25 ～0;80 min，20∶80);進(jìn)樣量10 μL;流速1 mL/min;

檢測(cè)波長(zhǎng):203 nm;柱溫:30℃。

1.2.3.2 蟲草素和腺苷的HPLC測(cè)定

精確稱取蝙蝠蛾擬青霉、蛹草擬青霉蟬擬青霉的發(fā)酵產(chǎn)物0.1 g，于3 mL 20%甲醇溶解，超聲90 min，0.45 μm微孔濾膜濾過，進(jìn)行HPLC檢測(cè)。

色譜流動(dòng)相:甲醇∶水梯度洗脫=15∶85;進(jìn)樣量10 μL;流速1 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm;柱溫:30℃。

1.2.3.3 甘露醇的測(cè)定

按比色法［17］測(cè)發(fā)酵產(chǎn)物的甘露醇含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵產(chǎn)物的收率

3種擬青霉在發(fā)酵培養(yǎng)基中生長(zhǎng)狀況良好，發(fā)酵周期20 d。將其發(fā)酵產(chǎn)物烘干至恒重，粉碎，計(jì)算發(fā)酵產(chǎn)物的收率(產(chǎn)物收率 =產(chǎn)物質(zhì)量 /5 g×100%)，見表1。

表1 發(fā)酵產(chǎn)物的收率(n=3)Table 1 The residue of fermentation productions

蝙蝠蛾擬青霉、蛹草擬青霉和蟬擬青霉均能很好的利用三七中提供的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)作為其生長(zhǎng)所需，發(fā)酵周期為20 d，其發(fā)酵產(chǎn)物收率都在70%左右。

2.2 發(fā)酵產(chǎn)物皂苷的HPLC分析

經(jīng)HPLC檢測(cè)發(fā)酵產(chǎn)物有效成分，表明蝙蝠蛾擬青霉和蛹草擬青霉能夠高產(chǎn)人參皂苷Rd，而蟬擬青霉則無明顯變化，其固體發(fā)酵三七的皂苷HPLC色譜圖見圖1。

皂苷產(chǎn)量對(duì)發(fā)酵底物的得率計(jì)算為:皂苷得率=每克產(chǎn)物中皂苷含量 ×產(chǎn)物收率。菌株蝙蝠蛾擬青霉、蛹草擬青霉和蟬擬青霉固體發(fā)酵三七的皂苷HPLC檢測(cè)結(jié)果如表2。經(jīng)過蝙蝠蛾擬青霉和蛹草擬青霉的發(fā)酵，Rd由原藥材的6.17 mg/g，分別增加至25.08 mg/g和25.07 mg/g，增加了3.06倍;同時(shí)，小極性皂苷Rh1、F1、F2、Rg3和C-K也有所增加;而三七中主要的皂苷成分R1、Re和Rg1則出現(xiàn)不同程度的下降，Rb1由原藥材的24.04 mg/g分別降至1.25 mg/g和4.24 mg/g。而經(jīng)過蟬擬青霉的發(fā)酵，三七中主要的皂苷成分R1、Re、Rg1和Rb1都有不同程度的下降，同時(shí)小極性皂苷 Rh1、F1、Rd、F2、Rg3 和 C-K則有小幅度的增加，但無顯著變化。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品(A)，原藥材(B)，蝙蝠蛾擬青霉轉(zhuǎn)化三七皂苷(C)，蛹草擬青霉轉(zhuǎn)化三七皂苷(D)，蟬擬青霉轉(zhuǎn)化三七皂苷(E)的HPLC色譜圖1－三七皂苷R1;2－人參皂苷Rg1;3－人參皂苷Re;4－人參皂苷Rb1;5－人參皂苷Rh1;6－人參皂苷F1;7－人參皂苷Rd;8－人參皂苷F2;9－人參皂苷Rg3;10－人參皂苷C-KFig.1 HPLC chromatograms of standard compounds(A)，raw Panax notoginseng(B)，ginsenoside of raw Panax notoginseng biotransformation with Paecilomyces hepiali Chen＆Dai(C)，ginsenoside of raw Panax notoginseng biotransformation with Paecilomyces militaris Liang(D)，and ginsenoside of raw Panax notoginseng biotransformation with Paecilomyces cicadae Samson(E)

表2 3株擬青霉發(fā)酵三七的皂苷含量變化Table 2 The contents of Panax notoginseng saponins fermented by the three Paecilomyces fungi

由人參皂苷轉(zhuǎn)化途徑［19］可知，在發(fā)酵過程中蝙蝠蛾擬青霉和蛹草擬青霉或其生長(zhǎng)過程中分泌的豐富酶系可能會(huì)水解人參皂苷Rb1的糖基從而轉(zhuǎn)化為Rd。而蟬擬青霉可能沒有相應(yīng)的酶系，無法進(jìn)行人參皂苷的轉(zhuǎn)化。所選的蝙蝠蛾擬青霉和蛹草擬青霉能夠有效地使三七中主要的大極性皂苷轉(zhuǎn)化為小極性皂苷，且高產(chǎn)人參皂苷Rd。

2.3 發(fā)酵產(chǎn)物腺苷和蟲草素的HPLC分析

蝙蝠蛾擬青霉、蛹草擬青霉和蟬擬青霉發(fā)酵產(chǎn)物的腺苷和蟲草素HPLC色譜圖見圖2。

菌株蝙蝠蛾擬青霉、蛹草擬青霉和蟬擬青霉固體發(fā)酵三七的腺苷和蟲草素HPLC檢測(cè)結(jié)果如表3。經(jīng)過蝙蝠蛾擬青霉的發(fā)酵，腺苷含量從原藥材中的21.06 μg/g 增加到發(fā)酵產(chǎn)物中的 385.67 μg/g，不含蟲草素;經(jīng)蛹草擬青霉發(fā)酵，產(chǎn)物中腺苷達(dá)到167.43 μg/g，蟲草素達(dá)到868.53 μg/g;而經(jīng)蟬擬青霉的發(fā)酵，產(chǎn)物的腺苷達(dá)到222.07 μg/g，不含蟲草素。

表3 3株擬青霉發(fā)酵三七的腺苷和蟲草素含量變化Table 3 The contents of Panax notoginseng adenosine and cordycepin fermented by the three Paecilomyces fungi

圖2 標(biāo)準(zhǔn)品(A)，原藥材(B)，蝙蝠蛾擬青霉發(fā)酵三七中腺苷和蟲草素(C)，蛹草擬青霉發(fā)酵三七中腺苷和蟲草素(D)，蟬擬青霉發(fā)酵三七中腺苷和蟲草素(E)的HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of standard compounds(A)，raw Panax notoginseng(B)，adenosine and cordycepin of raw Panax notoginseng fermentation with Paecilomyces hepiali Chen＆ Dai(C)，adenosine and cordycepin of raw Panax notoginseng fermentation with Paecilomyces militaris Liang(D)，and adenosine and cordycepin of raw Panax notoginseng fermentation with Paecilomyces cicadae Samson(E)

腺苷是蟲草的主要活性成分，在改善心腦血液循環(huán)和防止心律失常等方面有明顯的藥理作用。蝙蝠蛾擬青霉、蛹草擬青霉和蟬擬青霉發(fā)酵產(chǎn)物的腺苷含量為 385.76 μg/g、167.43 μg/g 和 222.07 μg/g，介于夏文娟報(bào)道的不同產(chǎn)地冬蟲夏草的腺苷含量(142.5 ～396.6 μg/g)之間［20］，與野生冬蟲夏草中腺苷含量相當(dāng)。蟲草素具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤，以及抗疲勞、抗衰老，提高人體免疫力等多種功效顯著的生物學(xué)活性，但在天然的蟲草中一般含量都不高。蛹草擬青霉發(fā)酵產(chǎn)物的蟲草素含量為868.53 μg/g，明顯高于索菲婭等報(bào)道的4個(gè)不同產(chǎn)地的冬蟲夏草(4.2 ～38.9 μg/g)［21］。由此可知，蝙蝠蛾擬青霉、蛹草擬青霉和蟬擬青霉能夠利用三七中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)發(fā)酵，從而有效地提高了腺苷和蟲草素這兩種蟲草功效成分。

2.4 發(fā)酵產(chǎn)物甘露醇的含量測(cè)定

菌株蝙蝠蛾擬青霉、蛹草擬青霉和蟬擬青霉固體發(fā)酵三七的甘露醇檢測(cè)結(jié)果如表4。

表4 3株擬青霉發(fā)酵三七的甘露醇含量變化(n=3)Table 4 The contents of Panax notoginseng mannito fermented by the three Paecilomyces fungi

經(jīng)擬青霉的發(fā)酵，甘露醇含量從原藥材的1.39%增加到了其產(chǎn)物中的9.68%、9.41%和8.22%，介于索菲婭等報(bào)道的4個(gè)不同產(chǎn)地冬蟲夏草的甘露醇含量(7.85% ～12.03%)之間［22］，同時(shí)也高于新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn)WS3-181(Z-60)-94(Z)發(fā)酵蟲草菌粉的甘露醇要求。說明所選的蝙蝠蛾擬青霉、蛹草擬青霉和蟬擬青霉都能發(fā)酵三七從而產(chǎn)生甘露醇，且與野生的冬蟲夏草中的甘露醇含量相當(dāng)。

3 討論

微生物發(fā)酵中藥，是現(xiàn)代生物技術(shù)和中藥研究的完美結(jié)合。微生物與中藥共同發(fā)酵，可使微生物中豐富的酶系與中藥中復(fù)雜的化學(xué)成分反應(yīng)，產(chǎn)生中藥不具有的成分或改變某些成分含量，或可使培養(yǎng)物兼有微生物和中藥的功效成分［11］，協(xié)同作用增強(qiáng)藥效，使人體可以吸收較完全，提高了治療和保健功效，從而可能為新藥開發(fā)提供一種新的途徑，是頗具發(fā)展?jié)摿Φ难芯款I(lǐng)域。

本研究采用蝙蝠蛾擬青霉、蛹草擬青霉和蟬擬青霉在三七培養(yǎng)基上進(jìn)行固體發(fā)酵，這3種擬青霉都能很好地利用三七中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行生長(zhǎng)，發(fā)酵周期為20 d，其發(fā)酵產(chǎn)物收率都在70%左右。通過對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的皂苷進(jìn)行HPLC檢測(cè)，蝙蝠蛾擬青霉和蛹草擬青霉的發(fā)酵產(chǎn)物中，Rb1由原藥材的24.04 mg/g分別降至1.25 mg/g和4.24 mg/g，Rd由原藥材的6.17 mg/g分別增加至25.08 mg/g和25.07 mg/g，增加了3倍。而Rb1和Rd具有相同的糖苷配基，其結(jié)構(gòu)差異僅在C20位上的糖基。Rb1可在葡萄糖苷酶的作用下，斷裂C20位上的末端糖苷鍵，脫去1分子葡萄糖，形成人參皂苷Rd［23］，如圖3。由于Rd在西洋參中含0.1% ～0.2%，人參中含0.2% ～0.3%，三七中含0.5% ～0.7%［24］，在植物原藥材中含量較低，但 Rd可能成為治療腦中風(fēng)的新型藥物，具有獨(dú)特的藥理作用，因此篩選出可以高產(chǎn)人參皂苷Rd的菌種，優(yōu)化合適的工業(yè)生產(chǎn)條件，對(duì)于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)稀有人參皂苷以及臨床的應(yīng)用具有重要意義。目前，已經(jīng)從蝙蝠蛾擬青霉和蛹草擬青霉中克隆出β-葡萄糖苷酶基因，正在進(jìn)行該酶的酵母真核表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建。

圖3 人參皂苷Rb1到Rd的轉(zhuǎn)化途徑Fig.3 The transformation pathway of ginsenoside Rb1 into ginsenoside Rd

與此同時(shí)，三七中的糖類、氨基酸、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和微量元素等也為蝙蝠蛾擬青霉、蛹草擬青霉和蟬擬青霉的菌絲體生長(zhǎng)提供了C源、N源和生長(zhǎng)因子等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，合成了腺苷、蟲草素和甘露醇這3種蟲草的功效成分。其發(fā)酵產(chǎn)物的腺苷含量和甘露醇含量與天然冬蟲夏草中相當(dāng)，而蛹草擬青霉發(fā)酵產(chǎn)物中的蟲草素含量為868.53 μg/g，要遠(yuǎn)高于天然冬蟲夏草中的蟲草素含量(4.2 ～38.9 μg/g)。

本研究使用3種擬青霉對(duì)三七原藥材進(jìn)行固體發(fā)酵，其中蝙蝠蛾擬青霉和蛹草擬青霉在轉(zhuǎn)化三七中皂苷的同時(shí)合成腺苷、蟲草素和甘露醇這三種蟲草功效成分，一次發(fā)酵過程同時(shí)獲得蟲草和三七有效成分。采用藥用真菌以三七原藥材為底物進(jìn)行發(fā)酵，三七與真菌構(gòu)成完整的發(fā)酵體系，三七為蟲草菌絲體的生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，使其合成蟲草的相關(guān)功效成分，而蟲草真菌所產(chǎn)生的糖苷酶又可對(duì)皂苷進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，水解其側(cè)鏈上的糖基，把原藥材中含量高的皂苷轉(zhuǎn)化為含量低、活性高的稀有皂苷，改善了藥材中活性化合物的生物利用度，發(fā)酵產(chǎn)物兼具三七和藥用真菌的雙重功效，為新藥開發(fā)提供新的思路。

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