周小兵，鄭璞

(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇無錫，214122)

丁二酸又名琥珀酸，是三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物，在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、食品、化工領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用［1］。目前商業(yè)化的丁二酸主要由化學(xué)法制得［2］，該法依賴于不可再生的石化資源，同時(shí)存在環(huán)境污染問題［3］。微生物厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸是利用微生物將糖和CO2轉(zhuǎn)化成丁二酸，可以擺脫丁二酸產(chǎn)品對化石原料的依賴，具有環(huán)境友好，緩解溫室效應(yīng)的優(yōu)勢。生物基丁二酸2004年經(jīng)美國能源部評估，被認(rèn)為是未來12種最有價(jià)值的生物基化學(xué)品之一［3］。雖然微生物發(fā)酵法生產(chǎn)丁二酸具有廣闊的前景，但發(fā)酵成本偏高影響著其工業(yè)化的進(jìn)程，而尋找廉價(jià)易得的原料是降低成本的有效手段之一。

白酒酒糟是釀酒工業(yè)最主要的副產(chǎn)物，2011年我國白酒產(chǎn)量達(dá)到1 025.55萬kL［4］，固態(tài)法生產(chǎn)1 t白酒約產(chǎn)生10 t酒糟［5］，我國白酒酒糟產(chǎn)量近1億t。濕酒糟含有大量水分(60% ～70%)，還有殘余糖和淀粉，酸度高，不易保存，容易腐爛變質(zhì)，造成嚴(yán)重的環(huán)境污染。同時(shí)酒糟中含有的纖維素、蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素和多種微量元素也得不到合理有效的利用，造成資源浪費(fèi)。目前對酒糟的綜合利用開始受到廣泛的關(guān)注，除了傳統(tǒng)的作為飼料［6］和肥料［7］，利用酒糟培養(yǎng)食用菌［8］，提取蛋白質(zhì)［9］、植酸［10］、復(fù)合氨基酸和微量元素［11］，以及利用發(fā)酵生產(chǎn)沼氣［12］、食醋［13］、甘油［14］等的研究也在進(jìn)行。本課題組先后開展了以廢糖蜜［15］、菊芋［16］和秸稈［17］為原料發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的研究。本文旨在研究以白酒酒糟為原料發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的工藝路線，一方面為發(fā)酵丁二酸生產(chǎn)提供新的原料來源，另一方面又為白酒酒糟綜合利用提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與酶

琥珀酸放線桿菌A.succinogenes F3－21，由本實(shí)驗(yàn)室保藏［18］;纖維素酶10 000 U/mL，購自康地恩生物集團(tuán);纖維二糖酶購自Sigma公司，≥250 U/mL。耐高溫α-淀粉酶20 000 U/mL，購自山東杰諾生物酶有限公司;糖化酶(100 000 U/mL)購自山東隆大生物工程有限公司。

1.1.2 原料

白酒酒糟，由四川瀘州老窖集團(tuán)有限公司提供，經(jīng)干燥粉碎，過40目篩，其成分經(jīng)測定為:粗蛋白17.15%，粗纖維37.91%(木質(zhì)素10.68%，纖維素19.34%，半纖維素7.89%，其中纖維素半纖維素共27.23%，為方便表述將其統(tǒng)稱為纖維素)，粗脂肪6.02%，無氮浸出物 39.76%，灰分 9.16%，淀粉12.35%。

1.1.3 培養(yǎng)基

種子活化培養(yǎng)基:參照文獻(xiàn)［18］。

分批發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):白酒酒糟80～400酶水解液(含固型物)，K2HPO4·3H2O 1.5，NaH2PO4·2H2O 1.5，MgCl2 ·6H2O 0.2，CaCl20.2。

同步糖化發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)白酒酒糟:160～320，K2HPO4·3H2O 1.5，NaH2PO4·2H2O 1.5，MgCl2·6H2O 0.2，CaCl20.2。

1.1.4 儀器

SHZ-88A往復(fù)式恒溫水浴振蕩器，蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;752紫外可見光分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司;厭氧培養(yǎng)箱YQX-Ⅱ上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠;7 L攪拌發(fā)酵罐，NBS BIOFLO 110 Fermentor;高效液相色譜儀，美國Waters 1512。

1.2 方法

1.2.1 成分分析方法

粗纖維成分分析采用Van Soest法［19］，蛋白質(zhì)含量分析方法采用凱氏定氮法［19］，淀粉含量分析采用酸水解法［19］，粗脂肪含量分析采用索氏抽提法［19］，灰分分析方法采用灼燒法，還原糖含量測定采用3，5-二硝基水楊酸比色法［20］，有機(jī)酸含量分析方法采用離子排斥高效液相色譜法［21］。

1.2.2 白酒酒糟中纖維素與淀粉的水解

纖維素水解:稱8 g酒糟，加水25 mL調(diào)pH至4.8，加纖維素酶和纖維二糖酶(用量分別為5 000 U/g DGS和50 U/g DGS)于50℃恒溫水浴水解。

淀粉水解:10 g酒糟加水至25 mL，加α-淀粉酶(2 400 U/g DGS)于90℃液化1 h，冷卻調(diào) pH 4.5，加糖化酶(1 800 U/g DGS)于60℃恒溫水浴水解。

淀粉和纖維素分步水解:10 g酒糟加水至25 mL，按上述的酶用量與水解條件，先纖維素或淀粉依次水解。

淀粉和纖維素同時(shí)水解:10 g酒糟加水至25 mL，先加 α-淀粉酶液化，90℃1 h再調(diào) pH 4.5 ～4.8，同時(shí)加入纖維素酶和淀粉酶，在50℃或60℃下恒溫水解。

1.2.3 發(fā)酵方法

分步糖化發(fā)酵:2、4、6、8、10 g 酒糟分別加水至25 mL，先加纖維素酶和纖維二糖酶在50℃、pH 4.8條件下恒溫水浴8 h，然后加 α-淀粉酶在90℃ pH 6.0條件下液化1 h，再加糖化酶在60℃、pH 4.5條件下恒溫水浴4 h，然后補(bǔ)加無機(jī)鹽配制成發(fā)酵培養(yǎng)基，調(diào)節(jié) pH 6.5，121℃滅菌 20 min，37℃在 CO2環(huán)境下培養(yǎng)48 h，分析發(fā)酵液有機(jī)酸含量。

同步糖化發(fā)酵:4、5、6、7、8 g 酒精加水至 25 mL，先加纖維素酶和纖維二糖酶在50℃ pH 4.8條件下水解8 h，然后再加α-淀粉酶在90℃ pH 6.0條件下液化1 h，然后補(bǔ)加無機(jī)鹽配制成發(fā)酵培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)pH 6.5，121℃滅菌20 min，接種發(fā)酵20 h后，加入膜濾的糖化酶，37℃在CO2環(huán)境下培養(yǎng)48 h，分析發(fā)酵液有機(jī)酸含量。

其中，c為還原糖濃度，g/L;c0為丁二酸濃度，g/L;C為酒糟濃度，g/L;ω1，ω2分別為酒糟中纖維素半纖維素含量;ω3為酒糟中淀粉含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 白酒酒糟中纖維素和淀粉的分別水解

2.1.1 纖維素酶水解酒糟

白酒酒糟含有約37.91%的粗纖維(其中纖維素和半纖維素共27.23%)，加纖維素酶和纖維二糖酶后纖維素和半纖維素轉(zhuǎn)化為還原糖，可供琥珀酸放線桿菌利用。圖1顯示，在50℃，pH 4.8條件下，前4 h白酒酒糟中纖維素的水解速率最快，4 h至8 h期間水解速率減慢，8 h之后，還原糖量增加極少，水解率為43.31%，最終還原糖濃度達(dá)到35.5 g/L，還原糖對酒糟得率約110 mg/g酒糟，纖維素水解率為44.04%，為減少能耗，水解時(shí)間確定為8 h。

圖1 水解時(shí)間對酒糟纖維素水解的影響Fig.1 Effect of time on hydrolysis of cellulose in SDG

2.1.2 糖化酶水解酒糟

酒糟中殘留12.35%淀粉，通過α-淀粉酶和糖化酶水解后，才能被琥珀酸放線桿菌利用。如圖2所示，400 g/L酒糟中淀粉經(jīng)過α-淀粉酶水解后，加入糖化酶，經(jīng)4 h還原糖濃度達(dá)到49.8 g/L，水解率為90.67%，4 h后還原糖含量略有增加，最終還原糖濃度為50.6 g/L，還原糖對酒糟得率約126 mg/g酒糟，淀粉水解率為92.26%。

圖2 時(shí)間對酒糟淀粉水解的影響Fig.2 Effect of time on hydrolysis of starch in SDG

2.2 纖維素酶和糖化酶共同水解白酒酒糟

如表1所示，先水解白酒酒糟中的纖維素，后水解其中的淀粉時(shí)，淀粉水解率僅為8.6%;而先水解白酒糟中淀粉再加纖維素酶水解其中的纖維素時(shí)，纖維素水解率也僅為9.1%。后者總還原糖得率略高，但遠(yuǎn)低于兩種酶單獨(dú)作用之和(110+126)mg/g，其原因可能是葡萄糖濃度達(dá)到一定量時(shí)，糖苷水解酶活性受到產(chǎn)物的反饋抑制，后水解組分水解率低。分別在纖維素酶或糖化酶作用的最適反應(yīng)溫度和pH條件下，同時(shí)用兩種酶進(jìn)行水解酒糟，結(jié)果兩者水解所產(chǎn)生的還原糖濃度相差不大(約為60 g/L)，且與分步水解的總還原糖得率相當(dāng)，進(jìn)一步說明了產(chǎn)物對糖苷水解酶的抑制可能是制約還原糖濃度提高的主要原因。

表1 酶水解順序?qū)圃闼獾挠绊慣able 1 Effect of enzymes adding order on hydrolysis of SDG

2.3 不同濃度酒糟對酒糟分步糖化發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的影響

初始酒糟濃度與初始還原糖濃度直接相關(guān)，初始糖濃度對丁二酸的發(fā)酵有明顯影響。圖3顯示，隨著酒糟濃度的增加，水解得到的還原糖濃度升高，發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的濃度也增加。酶處理后得到的酒糟水解液中固形物也增多，同時(shí)由酒糟所帶入的乳酸也增加，使得發(fā)酵丁二酸產(chǎn)率的增加變緩。酒糟濃度為400 g/L時(shí)，還原糖濃度為58.3 g/L，丁二酸產(chǎn)量為28.8 g/L。

圖3 不同酒糟濃度對分步糖化發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的影響Fig.3 Effect of SDG concentration on the production of succinic acid using separate hydrolysis and fermentation method

2.4 不同濃度酒糟對酒糟同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的影響

由于酶水解酒糟時(shí)，水解產(chǎn)物對酶反應(yīng)存在一定的反饋抑制作用，而且經(jīng)過α-淀粉酶處理后，糖化酶在37℃，pH 6.5時(shí)仍能水解酒糟中淀粉，進(jìn)行了同步糖化發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖4所示。隨著酒糟濃度的增加，初始還原糖濃度增加，但發(fā)酵的殘?zhí)且苍黾樱l(fā)酵后丁二酸濃度先增后減，雜酸(乳酸、甲酸和乙酸)濃度增加，推測可能是發(fā)酵受到產(chǎn)物抑制。酒糟濃度為240 g/L時(shí)，經(jīng)過纖維素酶作用之后得到還原糖35.5 g/L，然后加α-淀粉酶液化，再加糖化酶同步發(fā)酵后丁二酸濃度達(dá)到32.0 g/L。相同酒糟用量下，比分步糖化發(fā)酵的丁二酸的濃度提高了37.3%。對酒糟產(chǎn)率從72 mg/g酒糟增加到133 mg/g酒糟。

圖4 不同酒糟濃度對同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的影響Fig.4 Effect of SDG concentration on the production of succinic acid using separate hydrolysis and fermentation method

3 結(jié)論

白酒酒糟酶法處理過程中，用纖維素酶和糖化酶水解白酒酒糟，得到的還原糖得率要低于2種酶單獨(dú)水解的還原糖得率之和，白酒糟經(jīng)兩種酶水解后總還原糖得率約為150 mg/g酒糟。采用先水解白酒酒糟，后發(fā)酵白酒酒糟水解液的分步糖化發(fā)酵工藝，其較佳的白酒酒糟用量為400 g/L，發(fā)酵液丁二酸濃度為28.8 g/L;采用先水解白酒糟中纖維素，后對其淀粉進(jìn)行同步糖化發(fā)酵的工藝，較佳的白酒酒糟用量為240 g/L，發(fā)酵液中丁二酸濃度為32 g/L。比較兩種工藝，同步糖化發(fā)酵工藝的丁二酸產(chǎn)率(133 mg/g)是分步糖化發(fā)酵(72 mg/g)的1.8倍，具有明顯優(yōu)勢。

白酒酒糟用于生產(chǎn)丁二酸不需要外源添加氮源，不需要像秸稈、玉米芯等原料耗費(fèi)大量酸堿進(jìn)行預(yù)處理，具有一定的優(yōu)勢。白酒酒糟發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸既為發(fā)酵丁二酸生產(chǎn)提供了新的原料來源，又為白酒酒糟綜合利用提供了新的途徑，具有一定的應(yīng)用前景。

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