陶阿麗，戴一，華芳

(安徽新華學(xué)院 藥學(xué)院，安徽合肥，230088)

桂花(Osmanthus fragrans Lour)又名木犀，為常綠喬木或灌木。桂花是珍貴的觀賞性芳香植物，也是我國(guó)主要芳香原料之一，分布較廣。中醫(yī)認(rèn)為，桂花性溫味辛，煎湯、泡茶或浸酒內(nèi)服，可以化痰散瘀，對(duì)食欲不振、痰飲咳喘、腸風(fēng)血痢、閉經(jīng)腹痛有一定療效。研究表明，桂花含有豐富的脂肪、蛋白質(zhì)、碳水化合物及多種氨基酸、維生素等成分，其中蘊(yùn)含的總黃酮類物質(zhì)具有減少和消除自由基、抗氧化、抗血栓、抗癌、抗炎、降血脂、預(yù)防心臟病、抑菌、免疫調(diào)節(jié)等作用［1－3］。近年來由于自由基生命科學(xué)的進(jìn)展，使具有很強(qiáng)抗氧化性和消除自由基作用的黃酮類物質(zhì)受到重視［4－5］。本實(shí)驗(yàn)將具體研究桂花中總黃酮的適宜提取工藝，及不同開放形態(tài)下桂花中總黃酮的含量。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

桂花(采自安徽新華學(xué)院校園，經(jīng)慶兆老師鑒定為金桂，于2012年9月13日桂花開苞開始采摘，3 d采摘1次，至花謝共采摘4次，采摘后置于干燥箱中恒溫36℃烘干保存)、蘆丁對(duì)照品(中藥固體制劑制造技術(shù)國(guó)家工程研究中心，1198－101018)、硝酸鋁、亞硝酸鈉、無水乙醇等均為分析純。

DZF-6020型真空干燥箱(上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司);UV-4802S型紫外可見分光光度儀(尤尼柯(上海)儀器有限公司;FA2004型電子天平(上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 供試品溶液的制備［6］

精密稱取1.0 g干燥的桂花，置于圓底燒瓶中，恒溫浸提后，將乙醇浸提液用過濾，用蒸餾水定容至100 mL即得。

1.2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

精密量取0.192 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液1.50 mL，至于10 mL容量瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇于5 mL，加入5%亞硝酸鈉0.3 mL，搖勻，放置6 min;再加入10%硝酸鋁0.3 mL，搖勻，放置6 min;加入1.0 mol/L NaOH溶液4.0 mL，加水至刻度，搖勻，放置15 min，以不加蘆丁對(duì)照品的溶液為空白，選擇于在外分光光度在450～600 nm波長(zhǎng)內(nèi)掃描。

1.2.3 對(duì)照品溶液制備與標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制［7］

精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，置于小燒杯中，用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶解并轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中定容，搖勻，既得0.200 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密量取蘆丁對(duì)照品溶液 0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00 mL，分別置于25 mL容量瓶中，各加入體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇至10 mL，加入5%亞硝酸鈉1.00 mL，搖勻，放置6 min;再加入10%Al(NO3)3溶液1.00 mL，搖勻，放置6 min;加入1.0mol/L NaOH溶液10 mL，加水至刻度，搖勻，放置15 min，以不加蘆丁對(duì)照品溶液為空白，在510nm處測(cè)吸光度，以蘆丁濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本實(shí)驗(yàn)選定乙醇濃度(A)、液料比(B)、提取次數(shù)(C)、提取時(shí)間(D)4個(gè)因素，采用L9(34)正交安排表實(shí)驗(yàn)，因素與水平見表1，實(shí)驗(yàn)安排見表2。

1.2.5 采收期的選擇

取不同采收期桂花按優(yōu)化工藝進(jìn)行提取后制備供試品溶液備測(cè)。

表1 因素與水平Table 1 Factors and levels

1.2.6 樣品分析

對(duì)正交試驗(yàn)及采收期供試品溶液按1.2.3項(xiàng)下方法進(jìn)行顯色，紫外分光光度計(jì)測(cè)定吸光度，計(jì)算樣品中總黃酮含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

蘆丁溶液檢測(cè)波長(zhǎng)研究的掃描結(jié)果見圖1。在波長(zhǎng)450～510 nm之間吸光度不斷增大，當(dāng)波長(zhǎng)超過510 nm之后，吸光度呈下降趨勢(shì)，因此確定測(cè)定波長(zhǎng)為510 nm。

圖1 檢測(cè)波長(zhǎng)掃描圖Fig.1 The scanning figure of detecting wavelength

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

通過測(cè)定不同濃度的蘆丁對(duì)照品溶液吸光度，以濃度(c，mg/mL)對(duì)吸光度A進(jìn)行回歸分析，得回歸方程為:A=0.100 8c+0.030 5(R2=0.993)，蘆丁在0.008～0.048 mg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

準(zhǔn)確吸取蘆丁對(duì)照品溶液2.00 mL于10 mL容量瓶中，加一定量 70%乙醇至 5 mL，加入 5%Na2NO2溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min;再加入10%Al(NO3)3溶液 0.3 mL，搖勻，放置 6 min;加入 1 mol/L NaOH溶液4 mL，加水至刻度，搖勻，放置15 min，以不加蘆丁對(duì)照品為空白，在510 nm處測(cè)定吸光度，連續(xù) 6次，平均吸光度為 0.406，RSD為1.02%，精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

精密吸取1份供試品溶液2 mL，按照1.2.3項(xiàng)下方法顯色，分別于間隔 0、10、20、30、40、50、60 min，在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，1 h內(nèi)吸光度值無明顯變化，RSD 1.28%，供試品溶液顯色后在1 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

按照供試品溶液的制備方法制備6份供試品溶液(藥材重量相同)，分別按照1.2.3項(xiàng)下方法顯色測(cè)定，計(jì)算多總黃酮含量，RSD 1.56%，此方法重復(fù)性良好。

2.4 正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果及分析見表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal test

由表2數(shù)據(jù)可以看出，浸提次數(shù)對(duì)桂花總黃酮的提取效果影響最大，其次是乙醇濃度，在這4個(gè)因素中，影響最小的是浸提時(shí)間，由此可知，各因素對(duì)提取效果影響順序?yàn)?浸提次數(shù)(C)＞乙醇濃度(A)＞液料比(B)＞浸提時(shí)間(D)。實(shí)驗(yàn)最佳條件為A3B3C3D2，即:乙醇濃度60%，每次液料比1∶30，浸提次數(shù)3次，浸提時(shí)間90 min。

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

為了考察所選擇最佳工藝的穩(wěn)定性，對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證。稱取桂花100 g，3份，按照優(yōu)選的工藝條件，即乙醇濃度60%，每次液料比1∶30，浸提次數(shù)3次，浸提時(shí)間90 min，依法測(cè)定其桂花總黃酮的含量，結(jié)果見表3。

表3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of verification test

由表3可以看出，該提取工藝穩(wěn)定、可靠，達(dá)到提取優(yōu)化的目的

2.6 不同時(shí)期采收的桂花對(duì)總黃酮提取的影響

在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)不同采收期的桂花進(jìn)行提取，按1.2.1制備供試品溶液，再按1.2.3顯色，測(cè)定吸光度，結(jié)果如表對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行編號(hào)，9月13日為A組，9月16日為B組，9月19日為C組，9月22日為D組，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4。

表4 不同采收期桂花中總黃酮的含量測(cè)定Table 4 Total flavonoids from Sweet-scented osmanthus in different harvest times

由表4可知，桂花花期中，總黃酮含量前期呈上升趨勢(shì)，盛開時(shí)總黃酮含量最大，凋謝時(shí)含量最少。

3 結(jié)論

桂花既可以作為觀賞植物，又具有一定的藥用價(jià)值，另外在食品開發(fā)方面具有重要的應(yīng)用，以桂花開發(fā)的食品眾多，且具有一定的保健價(jià)值。黃酮成分是桂花所含的一類重要的成分，具有多種藥理作用，如抗衰老［3］、抗癌等。研究桂花中的黃酮成分對(duì)于桂花保健食品的開發(fā)具有重要的價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)不但優(yōu)化了桂花中黃酮成分的浸提工藝，也考察了桂花中黃酮隨著生長(zhǎng)期的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律。對(duì)于桂花中黃酮成分的開發(fā)具有重要價(jià)值。

［1］ 雷明.桂花果類黃酮分離純化工藝及其抗氧化研究［J］.西南大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2011，334:77 －81.

［2］ 燕亞飛，何鋼，謝碧霞.桂花研究概況［J］.湖北林業(yè)科技，2006(3):37－40.

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