張培，李昕，劉蕓，劉曄瑋，駱姍，邸多隆，唐運昌

1(蘭州大學公共衛(wèi)生學院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生研究所，甘肅蘭州，730000)2(中國科學院蘭州化學物理研究所中科院西北特色植物資源化學重點實驗室和甘肅省天然藥物重點實驗室，甘肅蘭州，730000)

漿水是我國西北地區(qū)極具特色的發(fā)酵食品，一般是將原料(芹菜或苦苦菜等)先焯水后，再放入熱水中，用老漿水為引子，再加入面湯直至發(fā)酵成熟，湯汁略呈乳白色，口味酸醇清香，多在夏季釀制。漿水具有減肥、開胃、健身等功效［1－2］。

目前國內(nèi)對于漿水的研究主要是漿水中微生物的分離鑒定［3－5］，而對其中營養(yǎng)物質(zhì)的研究較少。漿水富含有機酸，其有機酸的含量和種類維持漿水的酸堿平衡，影響漿水的口感及生物穩(wěn)定性。適量的有機酸能促進食欲，幫助消化，利于人體健康［6－7］。

高效液相色譜法分析有機酸簡單快速，可同時測定多種有機酸［8－9］，近年來不斷有文獻報道利用高效液相色譜法測定發(fā)酵食品中有機酸的方法［10－12］。本試驗采用HPLC法，通過優(yōu)化分析條件，建立了漿水中有機酸含量的分析方法。

1 材料與方法

1.1 樣品

蘭州市售漿水。

1.2 主要試劑

甲醇(色譜純)，山東禹王集團;KH2PO4(AR)，西隴化工廠;超純水，實驗室自制;H3PO4(AR)，天津歐博凱化工;酒石酸(AR)，上海圣宇化工;乙酸(AR)，煙臺雙雙化工;乳酸(AR)，天津光復(fù)精細化工;富馬酸(AR)，鄭州盛源化工。

1.3 儀器及設(shè)備

Agilent 1200高效液相色譜儀系統(tǒng)(包括G1311A四元梯度泵、G1315B DAD二極管陣列檢測器、手動進樣器和Agilent Chemstation工作站);Agilent ZORBAX SB-AQ 色譜柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)，大連依利特C18色譜柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);高速離心機，上海安亭科學儀器;高壓抽濾機，奧特賽恩斯公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 標準品溶液和樣品溶液的制備

分別精密稱取一定量酒石酸、乳酸、乙酸、富馬酸，用雙蒸水配制成標準溶液;精密量取一定量各標準溶液混合定容后，得到有機酸標準工作溶液，濃度分別為酒石酸0.4 mg/mL，乳酸6 mg/mL，乙酸1 mg/mL，富馬酸1 ×10－3mg/mL。

取適量漿水在8 000 r/min下離心10 min，取上清液備用。進樣前溶液用0.45 μm微孔濾膜過濾。

1.4.2 色譜條件

色譜柱:Agilent ZORBAX SB-AQ柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);檢測波長:210 nm;流動相:甲醇∶0.01 mol/L KH2PO4溶液(體積比 0.5∶99.5，KH2PO4溶液pH=2.0);流速:0.6 mL/min;柱溫:30℃;進樣量:20 μL。在優(yōu)選的色譜條件下，將1.4.1項下制備的標準品溶液和樣品溶液分別進樣分析(見圖1)。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 檢測波長的選擇

在200～600 nm對各有機酸標準品的光譜吸收進行掃描，結(jié)果顯示，λ=210 nm時，各有機酸都有較大吸收峰，所以選擇210 nm為檢測波長。

圖1 標準品和樣品的HPLC色譜圖Fig.1 The chromatogram of standard substance and sample

2.1.2 色譜柱的選擇

選用Agilent ZORBAX SB-AQ色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)和大連依利特C18色譜柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)，對樣品在2種色譜柱上的不同色譜行為進行了比較。結(jié)果顯示，采用C18色譜柱，在不同比例甲醇-KH2PO4溶液、不同 pH值不同濃度的KH2PO4溶液作為流動相時樣品中各有機酸均很難完全分離(見圖2)。而采用AgilentZORBAX SB-AQ色譜柱，在一定的條件下樣品中各有機酸分離結(jié)果較好(見圖1B)，故選用AgilentZORBAX SB-AQ柱。

2.1.3 緩沖溶液濃度的選擇

精密稱取一定量的KH2PO4，分別配制成濃度為0.005 mol/L，0.01 mol/L，0.02 mol/L 的緩沖溶液，考察緩沖液濃度對樣品中各有機酸分離效果的影響。結(jié)果表明，當KH2PO4溶液濃度為0.01 mol/L時，各有機酸分離效果較好(見圖1B、圖3)。

圖2 C18色譜柱樣品色譜圖Fig.2 The sample chromatogram of C18column

圖3 濃度為0.005 mol/L，0.02 mol/L的KH2PO4緩沖溶液色譜圖Fig.3 The chromatogram of KH2PO4buffer solution concentration at 0.005 mol/L and 0.02 mol/L

2.1.4 pH值的選擇

以0.01 mol/L KH2PO4溶液作流動相，用H3PO4調(diào)節(jié)流動相pH值分別為4.0、3.0和2.0，考察流動相pH值對樣品中有機酸分離的影響。結(jié)果表明，當pH=2時，各有機酸分離效果較好(見圖1B、圖4)。

2.2 方法學驗證

2.2.1 線性方程、線性范圍和檢出限

配制一系列不同濃度的有機酸標準品溶液，按1.4.2色譜條件分析，以被檢測物的峰面積為縱坐標(Y)，標準品溶液濃度為橫坐標(X)進行線性回歸;檢出限以信噪比(S/N)大于3時的檢測濃度計算。4種有機酸的線性方程、相關(guān)系數(shù)(R2)和檢出限見表1。從表1可以看出，在酒石酸、乳酸、乙酸、富馬酸的濃度分別為0.003～0.1 mg/mL，0.48～24 mg/mL，0.02～0.9 mg/mL，0.001～0.07 mg/mL范圍內(nèi)，4種有機酸呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

圖4 pH=3和pH=4樣品的色譜圖Fig.4 The chromatogram of sample at pH=3 and pH=4

表1 4種有機酸的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍與檢出限(n=3)Table 1 The linear equation，related coefficient，range of linearity and detection limit of the four organic acids(n=3)

2.2.2 方法精密度考察

按1.4.1條件處理樣品后，按1.4.2色譜條件連續(xù)測定5次，考察日內(nèi)精密度;連續(xù)進樣3 d，考察日間精密度。結(jié)果見表2。從表2可以看出，4種有機酸的日內(nèi)精密度的RSD%小于2%，日間精密度的RSD%小于5%，由此表明該液相色譜檢測方法精密度良好。

表2 4種有機酸的精密度考察Table 2 The relative standard deviations investigation of the four organic acids

2.2.3 回收率考察

精確量取樣品適量，在其中精確加入標準品混合溶液，按1.4.2色譜條件進樣分析，回收率結(jié)果見表3?；厥章蕦嶒灥慕Y(jié)果顯示該樣品方法可以滿足分析的要求。

表3 回收率考察(n=5)Table 3 The investigation of the recoveries(n=5)

2.3 樣品測定

精確量取樣品適量，按1.4.1條件處理樣品后，按1.4.2色譜條件測定樣品中4種有機酸含量，結(jié)果分別為:酒石酸 0.048 2 mg/mL;乳酸 4.912 5 mg/mL;乙酸0.275 0 mg/mL;富馬酸0.001 7 mg/mL(見表3)，表明漿水中有機酸以乳酸含量明顯高于其他3種有機酸的含量為特征。

3 討論

(1)建立了漿水中酒石酸、乳酸、乙酸、富馬酸含量的HPLC測定方法。結(jié)果表明，該方法簡單、快速、可靠。

(2)本試驗曾使用依利特C18柱分離漿水中的有機酸，發(fā)現(xiàn)只有當甲醇∶0.01 mol/L KH2PO4(v∶v=0.5∶99.5)時各有機酸分離效果較好，但是流動相中水的比例大于80%時，會影響C18色譜柱的使用壽命。有文獻報道［13］，C18色譜柱不適用于分離多種有機酸。ZORBAX SB-AQ柱通過對傳統(tǒng)的C18柱改性，具有親水性的表面，用于漿水中有機酸含量的測定得到了理想的結(jié)果。

(3)許多緩沖溶液在210 nm處都有吸收，而磷酸緩沖液在210 nm處幾乎無吸收，可作為有機酸測定的流動相，故本試驗選擇KH2PO4作為緩沖液。緩沖溶液濃度越高，酸的存在形式越穩(wěn)定，但當緩沖溶液的濃度過高時，離子強度增大，對組分分離不利，同時影響色譜柱的壽命，增加了流動相的本底吸收，降低了測定的靈敏度［14］。本試驗分別選擇緩沖液濃度為0.005 mol/L，0.01 mol/L，0.02 mol/L 考察對樣品分離效果的影響，當緩沖液濃度為0.005 mol/L時，乳酸出現(xiàn)前展現(xiàn)象，當緩沖液濃度為0.02 mol/L時，各有機酸分離效果和濃度為0.01 mol/L時相似，但高濃度磷酸鹽會影響色譜柱壽命，最終確定KH2PO4濃度為0.01 mol/L。

(4)通過調(diào)節(jié)流動相的pH值可抑制解離增加保留［15］。本試驗用 H3PO4調(diào)節(jié)流動相 pH值分別為4.0、3.0和2.0，當pH=3時乳酸出現(xiàn)前展現(xiàn)象且未達到基線分離，pH=4時乳酸的峰和前一個未知酸峰未完全分離，出現(xiàn)遮掩現(xiàn)象，當pH=2各有機酸的分離效果較好。

［1］ 孟憲剛，張麗珂，周鴿鴿.傳統(tǒng)發(fā)酵食品-漿水研究概況及發(fā)展前景展望［J］.食品工業(yè)科技，2010(10):402－404.

［2］ 杜鵬，霍貴成.傳統(tǒng)發(fā)酵食品及其營養(yǎng)保健功能［J］.中國釀造，2004，132(3):6 －8.

［3］ 張軼，王玉麗，陳曉前，等.傳統(tǒng)發(fā)酵食品—漿水中微生物的分離與初步鑒定［J］.食品科學，2007，28(1):219－222.

［4］ 張麗珂，周鴿鴿，孟憲剛.傳統(tǒng)發(fā)酵食品漿水中厭氧微生物分離鑒定初探［J］.食品科技，2010，35(4):39－41.

［5］ 張宗舟，陳志梅，鞏曉芳.漿水生產(chǎn)過程中的微生物分析［J］.中國釀造，2009，137(10):29－31.

［6］ 高衛(wèi)衛(wèi)，杜金華，于玲，等.櫻桃酒中有機酸種類和含量的研究［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2008，34(10):145－149.

［7］ 王玉君，李烈英，孫永樂，等.高效液相色譜法分析色酒中有機酸的研究［J］.色譜，1991，9(4):271－272.

［8］ 丁明玉，陳培榮，羅國安.食品中有機酸的高效液相色譜分析法［J］.色譜，1997，15(3):212－214.

［9］ 史春云，田晶，馬延和，等.反相高效液相色譜法測定嗜堿微生物發(fā)酵液中的有機酸［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2007，33(4):116－118.

［10］ 呂利華，梁麗絨，趙良啟.山西老陳醋中有機酸的HPLC測定分析［J］.食品科學，2007，28(11):456－459.

［11］ 黃慧敏，張偉國.反相高效液相色譜法測定蘋果酸發(fā)酵液中的有機酸［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2012，38(5):180－184.

［12］ 呂旭聰，黃志清，黃若蘭，等.反相高效液相色譜法同時快速測定黃酒和葡萄酒中有機酸的含量［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2010，36(6):132－136.

［13］ Suárez-Luque S，Mato I，Jose FH et al.Rapid determination of minority organic acids in honey by high-performance liquid chromatography［J］.J Chromatogr A，2002，955(2):207－214.

［14］ 楊 毅，李崎，陳蘊，等.反相高效液相色譜法(RPHPLC)測定啤酒中有機酸［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2003，29(8):6－12.

［15］ 賈洪峰，賀稚非，李洪軍，等.高效液相色譜法測定發(fā)酵辣椒中的有機酸［J］.食品科學，2008，29(3):374－379.