鄧丹雯，楊佩，呂建垚，張彬，黃贛輝

(南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江西南昌，330047)

楊梅素(3，5，7，3＇，4＇，5＇-六羥基黃酮)亦稱楊梅黃酮，是從楊梅樹皮和樹葉中提取出的多羥基黃酮類化合物［1－2］。楊梅素具有較強抗氧化活性、顯著的自由基清除能力、抗炎和抗腫瘤藥效，能夠降低血糖，預(yù)防糖尿病及糖尿病并發(fā)癥［3－5］，有很好的研究價值和經(jīng)濟價值。

鑒于目前國內(nèi)對楊梅素提取工藝的研究較少，本實驗以新鮮楊梅樹葉為原料，采用乙醇回流提取、C18固相萃取小柱純化［6］的方法，對楊梅素提取工藝進行研究。通過考察液料比、提取時間、提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)對楊梅素提取得率的影響，利用響應(yīng)面分析法對其提取工藝參數(shù)進行優(yōu)化［7－8］，以確定楊梅素提取最佳工藝條件，為楊梅素的應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

楊梅樹葉:荸薺種楊梅樹葉，采于江西樂平;選取新鮮楊梅樹葉，用蒸餾水洗凈，放入50℃烘箱烘干后粉碎，過40目篩后保存?zhèn)溆谩?/p>

楊梅素標(biāo)品:阿拉丁試劑(上海)有限公司，w＞98%;無水乙醇:分析純;甲醇、磷酸二氫鉀均為色譜純。

1.2 儀器

Aglient1260高效液相色譜儀(四元泵、紫外檢測器)，Simon Aldrich-C18固相萃取小柱，JT2003電子精密天平(河北路儀公路儀器有限分公司)，DFY－500搖擺式高速萬能粉碎機(溫嶺市林大機械有限公司)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE－52(上海亞榮生化儀器廠)，DHG－9053型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司)，DKS－24型電熱恒溫水浴鍋(嘉興市中新醫(yī)療儀器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 楊梅素的提取工藝流程

楊梅樹葉→烘干粉碎→40目篩分→回流提取→抽濾→楊梅素粗提液

1.3.2 楊梅素的提取

準(zhǔn)確稱取適量楊梅樹葉粉末置于單口圓底燒瓶，加入一定量的乙醇水溶液，控制一定溫度回流提取一定時間后，過濾，濾液即為楊梅素粗提液。

1.3.3 單因素影響實驗

準(zhǔn)確稱取10 g楊梅樹葉粉末，按1.3.2方法對楊梅素進行提取，主要考察液料比、提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時間因素對楊梅素提取的影響，具體因素水平見表1。

表1 單因素實驗因素水平表Table 1 Factors and levels of one-factor-at-a-time(OFAT)experiments

1.3.4 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝

在單因素實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，根據(jù)中心組合實驗Box-Behnken設(shè)計原理［9］，設(shè)計三因素三水平的響應(yīng)面分析實驗。

1.3.5 楊梅素的測定

1.3.5.1 楊梅素的測定方法

將楊梅素粗提液旋蒸至浸膏狀，甲醇溶解定容至50 mL，吸取0.5 mL用甲醇定容至25 mL后取5 mL通過活化好的Simon Aldrich-C18固相萃取小柱，棄去最初2滴開始收集［10］，用0.22 μm針頭過濾器過濾，高效液相外標(biāo)法進行分析。

1.3.5.2 HPLC檢測條件

色譜柱:Thermo-C18液相色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流動相:0.005 mol/L磷酸二氫鉀溶液-甲醇(體積比30∶70);流速為0.5 mL/min，進樣10 μL，柱溫25℃，檢測波長360 nm。

1.3.5.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

準(zhǔn)確稱取楊梅素標(biāo)品10 mg置100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，作為對照品溶液。用甲醇稀釋并定容，配成 10，20，30，40，50 μg/mL 系列濃度的楊梅素標(biāo)品溶液，10 μL進樣，在1.3.5.2色譜條件下進HPLC分析，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，以濃度為橫坐標(biāo)(X)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。所得回歸方程為Y=54.155X －161.47，R=0.999 6，表明樣品在 10～50 μg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.3.5.4 得率計算

提取得率/%=(楊梅素提取量/楊梅樹葉粉末干質(zhì)量)×100

2 結(jié)果與討論

2.1 HPLC檢測結(jié)果

在1.3.5.2色譜條件下，標(biāo)品和樣品在360 nm的波長處色譜圖如圖1和圖2所示。

圖1 標(biāo)品色譜圖Fig.1 Chromatogram of standard substance

2.2 單因素實驗結(jié)果與分析

2.2.1 液料比對楊梅素提取得率的影響

固定提取溫度為90℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)為90%、提取時間為 2 h，研究液料比(5∶1、10∶1、15∶1、20∶1)對楊梅素提取得率的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖2 樣品色譜圖Fig.2 Chromatogram of sample

圖3 液料比對楊梅素提取得率的影響Fig.3 Effect of liquid-to-material ratio on myricetin yield

由圖3可知，隨著液料比的增加，楊梅素提取得率提升，當(dāng)液料比為10∶1時，提取得率達到最大，但隨著液料比的繼續(xù)增加，楊梅素的提取得率反而略有下降，因此確定提取楊梅素的最佳液料比為10∶1。

2.2.2 提取溫度對楊梅素提取得率的影響

固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為90%、液料比為10∶1、提取時間為2h，研究提取溫度(65、75、85、95℃)對楊梅素提取得率的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 提取溫度對楊梅素提取得率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on myricetin yield

由圖4可知，當(dāng)提取溫度低于85℃時，隨著溫度的提升，楊梅素的提取得率增加;當(dāng)溫度為85℃，提取得率達到最大，但當(dāng)溫度繼續(xù)增加，楊梅素的提取得率反而下降，分析其原因是當(dāng)提取溫度低于85℃時，溫度升高越靠近乙醇的沸點越有利于回流提取，提取得率會增加，但楊梅素在長時間高溫條件下不穩(wěn)定［11］，當(dāng)溫度超過適宜溫度時，楊梅素的結(jié)構(gòu)被破壞，從而導(dǎo)致楊梅素的提取得率下降，因此確定提取楊梅素的最佳溫度為85℃。

2.2.3 提取時間對楊梅素提取得率的影響

固定提取溫度為85℃、液料比為10∶1、乙醇體積分?jǐn)?shù)為90%，研究提取時間(1、1.5、2、2.5 h)對楊梅素提取得率的影響，結(jié)果如圖5所示。

圖5 提取時間對楊梅素提取得率的影響Fig.5 Effect of extraction time on myricetin yield

由圖5可知，當(dāng)提取時間小于1.5 h時，隨著時間的延長，楊梅素的提取得率有所增加，但增加的程度變化不明顯;當(dāng)提取時間超過1.5 h，隨著時間的繼續(xù)延長，楊梅素的提取得率略有下降，其原因是提取包括擴散、滲透和溶解等過程，時間延長有助于楊梅素的溶出，從而提取得率上升，但楊梅素在長時間的高溫條件下不穩(wěn)定［11］，提取時間超過1.5 h后，楊梅素的結(jié)構(gòu)可能開始被破壞，從而導(dǎo)致楊梅素的提取得率略有下降。綜合考慮確定提取楊梅素的最佳時間為1.5 h。

2.2.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對楊梅素提取得率的影響

固定提取溫度為85℃、液料比為10∶1、提取時間為 1.5 h，研究乙醇體積分?jǐn)?shù)(65、75、85、95%)對楊梅素提取得率的影響。結(jié)果如圖6所示。

圖6 乙醇體積分?jǐn)?shù)對楊梅素提取得率的影響Fig.6 Effect of ethanol concentration on myricetin yield

由圖6可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)低于85%時，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，楊梅素的提取得率增加，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為85%，提取得率達到最大，分析其原因是楊梅素微溶于水，易溶于乙醇，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，楊梅素的提取得率上升，但當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達到95%時，提取溶液極性較小不利于楊梅素的提取，提取得率反而下降，因此確定提取楊梅素的最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)為85%。

2.3 響應(yīng)面實驗結(jié)果與分析

2.3.1 響應(yīng)面實驗結(jié)果

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，選取液料比、提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)為對提取楊梅素影響顯著的3個因素，以楊梅素提取得率為響應(yīng)值，因素水平編碼表見表2。

表2 響應(yīng)面因素水平編碼表Table 2 Factors and levers of response surface test

響應(yīng)面實驗結(jié)果如表3所示，通過Design Expert8.05數(shù)據(jù)分析軟件進行回歸分析，得到楊梅素提取得率(Y)對液料比(A)、提取溫度(B)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(C)的二次多項回歸模型為:

Y=1.29+0.24A+0.026B－0.042C－0.032AB+0.013AC+0.041BC－0.21A2－0.16B2－0.061 C2

表3 響應(yīng)面實驗結(jié)果Table 3 Test design and results of response surface analysis

2.3.2 回歸方程方差分析

方差分析結(jié)果如表4所示，由表4可以看出，模型Prob＞F值小于0.01，表明該模型方程極顯著，不同處理間的差異高度顯著，說明這種實驗方法是準(zhǔn)確可靠的，使用該方程模擬真實的三因素三水平的分析是可行的。由表4的Prob＞F值知，方程中A、A2、B2對楊梅素提取得率Y值的影響極顯著，C、C2對Y值的影響顯著，表明實驗因素對響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系，二次項對響應(yīng)值也有很大的影響，交互項作用的影響較小。從表4還可以看出，在所選取因素水平范圍內(nèi)，對楊梅素提取得率的影響大小依次為:液料比＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞提取溫度。且模型的復(fù)相關(guān)系數(shù)為R2=98.05%，大于90%，說明模型擬合程度良好，實驗誤差小，可以用于楊梅素提取實驗的理論預(yù)測。

表4 方差分析表Table 4 Analysis of variance for each term of the fitted regression equation

2.3.3 響應(yīng)面曲面分析

根據(jù)二次多項回歸模型作出的相應(yīng)的響應(yīng)面圖及等高線圖見圖7～圖9。響應(yīng)面的坡度變化及等高線的形狀可以反映各因素間的交互作用效應(yīng)［12］。

圖7 提取溫度和液料比對楊梅素提取得率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.7 Response surface plot and contour plot showing the interactive effect of extraction temperature and liquid-to-material ratio on myricetin yield

從圖7響應(yīng)面圖可以看出，當(dāng)固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為85%時，液料比A的變化引起的響應(yīng)面坡度變化較陡峭，而提取溫度B的變化引起的響應(yīng)面坡度變化相對平緩，說明在兩者的交互作用中液料比A相對于提取溫度B而言居于主要方面。由圖7等高線可知，橢圓在料液比A區(qū)域排列更密集，表明料液比A的變化對響應(yīng)值變化的影響更大;等高線的形狀偏圓形表示2個因素交互作用不太顯著。

從圖8響應(yīng)面圖可以看出，當(dāng)固定提取溫度為85℃時，液料比A的變化引起的響應(yīng)面坡度變化比乙醇體積分?jǐn)?shù)C更陡峭，說明在兩者的交互作用中，影響楊梅素提取得率的主要方面是液料比A。由圖8等高線圖可知，橢圓在料液比A區(qū)域排列更密集，表明料液比A的變化對響應(yīng)值變化的影響更大;等高線的形狀為橢圓形，表示液料比A和乙醇體積分?jǐn)?shù)C交互作用很顯著。

圖8 乙醇體積分?jǐn)?shù)和液料比對楊梅素提取得率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.8 Response surface plot and contour plot showing the interactive effect of ethanol concentration and liquid-to-material ratio on myricetin yield

圖9 提取溫度和乙醇體積分?jǐn)?shù)對楊梅素提取得率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.9 Response surface plot and contour plot showing the interactive effect of extraction temperature and ethanol concentration on myricetin yield

從圖9響應(yīng)面圖可以看出，當(dāng)固定液料比為10∶1時，乙醇體積分?jǐn)?shù)C的變化引起的響應(yīng)面坡度變化比提取溫度B更陡峭，說明在兩者的交互作用中，影響楊梅素提取得率的主要方面是乙醇體積分?jǐn)?shù)C。由圖9等高線圖可知，等高線的形狀為偏橢圓形，表示提取溫度B和乙醇體積分?jǐn)?shù)C交互作用較顯著。

2.4 驗證實驗

根據(jù)響應(yīng)面分析得出優(yōu)化條件為提取溫度84.86℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)82.09%、液料比為12.82∶1、提取時間1.5 h，回歸模型算出的理論預(yù)測值為1.36%;為證實回歸模型的可靠性，在此優(yōu)化條件下進行3次提取驗證實驗，結(jié)果如表5所示，將實驗值與預(yù)測值相比較，相對誤差僅為0.88%，由此證明該回歸模型的可靠性。

表5 驗證實驗結(jié)果Table 5 Verification results of myricetin extraction

3 結(jié)論

采用乙醇回流提取楊梅素，在提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取時間4個工藝條件中，液料比對楊梅素的提取得率影響達到極顯著水平，乙醇體積分?jǐn)?shù)對楊梅素的提取得率影響顯著，而提取溫度、提取時間對楊梅素的提取得率的影響不顯著。分析結(jié)果表明，楊梅樹葉中楊梅素的最佳提取條件為提取溫度84.86℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)82.09%、液料比為12.82∶1、提取時間1.5 h。在此條件下，楊梅素的提取得率可達1.355%。

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