孫來(lái)娣，高華，劉坤，孫偉紅，邢麗紅，苗鈞魁，冷凱良

1(中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東青島，266071)2(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山東青島，266021)

南極磷蝦粉是以南極磷蝦為原料，經(jīng)蒸煮、壓榨、烘干、粉碎等工序制成的具有獨(dú)特營(yíng)養(yǎng)功能和質(zhì)量屬性的水產(chǎn)動(dòng)物飼料［1］。由于含有豐富的優(yōu)質(zhì)蛋白、氨基酸、天然色素蝦青素、礦物質(zhì)元素以及低脂肪等，其在水產(chǎn)飼料中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，并發(fā)揮著不可比擬的優(yōu)勢(shì)［2－5］。有資料顯示，南極磷蝦粉中蝦青素含量在100～300 mg/kg［6］，其對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物可以起到強(qiáng)免疫、著色、保鮮的作用，是1種重要的魚類生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑［7－8］。目前有關(guān)蝦青素提取測(cè)定方法的研究主要集中在紅球藻和紅發(fā)夫酵母菌上，而有關(guān)南極磷蝦蝦青素的提取測(cè)定的研究報(bào)道甚少。

目前提取蝦青素最常用的方法是溶劑萃取法，該法工藝提取條件簡(jiǎn)單。本課題以南極磷蝦粉為原料，研究了溶劑浸提法提取蝦青素的實(shí)驗(yàn)條件，考察了提取溶劑、提取溫度、料液比、提取時(shí)間等因素對(duì)蝦青素含量的影響，并結(jié)合響應(yīng)曲面法優(yōu)化了蝦青素提取方法，以期為南極磷蝦的產(chǎn)業(yè)化開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)采用分光光度法測(cè)定磷蝦粉中的蝦青素，通過(guò)借鑒美國(guó)FDA法計(jì)算蝦青素含量。FDA公式計(jì)算法由于具有操作簡(jiǎn)便、無(wú)需標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品、數(shù)據(jù)真實(shí)可靠等優(yōu)點(diǎn)，與外標(biāo)一點(diǎn)法和標(biāo)準(zhǔn)曲線法相比具有明顯的優(yōu)勢(shì)，這為快速簡(jiǎn)便地測(cè)定磷蝦粉中的蝦青素提供了基礎(chǔ)［9－11］。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

UV-2000紫外-分光光度計(jì)，尤尼柯儀器有限公司;BSA224S-CW分析天平，賽多科斯科學(xué)儀器有限公司;CR22G高速冷凍離心機(jī)，日本Hitachi公司;N-EVAP112氮吹儀，美國(guó) Organomation公司;ISRDS3恒溫振蕩器，美國(guó)精湛有限公司;渦旋混合器，無(wú)錫活信儀器有限公司;甲醇、乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷、二甲基亞砜(DMSO)、丙酮、2，6-二叔丁基對(duì)甲酚(BHT)等有機(jī)試劑。

南極磷蝦粉樣品，由遼寧遠(yuǎn)洋漁業(yè)有限公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 提取測(cè)定方法

將南極磷蝦粉粉碎并過(guò)100目篩網(wǎng)，得到粗細(xì)均勻的粉末。準(zhǔn)確稱取上述粉末0.5 g，按一定料液比(mL∶g)加入二氯甲烷-甲醇(體積比 1∶3)溶液，于設(shè)定溫度下恒溫浸提一定時(shí)間。取出流水冷卻后，5℃、8 000 r/min離心5 min，取5 mL上清液氮?dú)獯蹈?，然后用DMSO溶解并定容至5 mL，以DMSO為參比溶液，于489 nm下測(cè)定吸光度值。

1.2.2 含量計(jì)算方法［9］

南極磷蝦粉中蝦青素的含量計(jì)算采用美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)提供的方法，其具體計(jì)算公式為:

式中:X為蝦青素的總含量，%;A489為489 nm下的吸光度值;V為提取樣品的體積，mL;f為稀釋倍數(shù);1908為消光系數(shù);m為所稱取的南極磷蝦粉質(zhì)量，g。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 單因素實(shí)驗(yàn)

在保持其他條件不變的情況下，分別考察提取溶劑、提取溫度、提取時(shí)間、料液比等主要因素對(duì)蝦青素提取效果的影響，具體的單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 南極磷蝦粉中蝦青素提取單因素試驗(yàn)Table 1 Univariate experiments for extracting astaxanthin from Antarctic krill powder

1.3.2 響應(yīng)曲面優(yōu)化法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)［12－13］

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)數(shù)學(xué)模型，確定二氯甲烷-甲醇(體積比1∶3)為提取溶劑，選取提取溫度、料液比、提取時(shí)間3個(gè)對(duì)蝦青素提取效果影響顯著的因素，分別以A、B和C為代表，每個(gè)自變量的低、中、高試驗(yàn)水平分別以－1、0、1進(jìn)行編碼。以蝦青素的含量(Y)為響應(yīng)值，對(duì)南極磷蝦粉中蝦青素的提取方法進(jìn)行三因素三水平優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，利用Design-Expert 7.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和回歸分析。具體的試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面分析因素與水平Table 2 Variables and levels in response surface design

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 提取溶劑對(duì)蝦青素提取效果的影響

由圖1可知，以混合試劑二氯甲烷-甲醇(體積比1∶3)為提取溶劑，所得樣品溶液的含量最大，而以乙酸乙酯、二氯甲烷、二甲基亞砜(DMSO)為提取溶劑的提取效果相當(dāng)。這是因?yàn)槲r青素是弱極性化合物，根據(jù)相似相容原理其在弱極性溶劑二氯甲烷中的溶解度較大;另外，較單一溶劑而言，復(fù)合溶劑則更易深入蝦粉組織細(xì)胞內(nèi)將結(jié)合在組織細(xì)胞中的蝦青素充分浸提出來(lái)，從而使得提取效果顯著。

同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)還考察了不同配比的二氯甲烷和甲醇對(duì)提取效果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著二氯甲烷比例的增加，蝦青素含量變化并不明顯，高比例的二氯甲烷反而使樣品中的脂質(zhì)成分被不同程度地浸提出來(lái)，導(dǎo)致溶液的渾濁度增加，這給樣品溶液的濃縮、測(cè)定帶來(lái)干擾。因此，綜合考慮各因素，實(shí)驗(yàn)選擇二氯甲烷-甲醇(體積比1∶3)為提取溶劑進(jìn)行后續(xù)研究。

圖1 提取溶劑對(duì)蝦青素提取效果的影響(n=3)Fig.1 Effect of extraction solvent on the extraction result of astaxanthin(n=3)

2.1.2 提取溫度對(duì)蝦青素提取效果的影響

由圖2可知，在20～50℃內(nèi)，隨著提取溫度的升高，蝦青素含量呈逐漸上升的趨勢(shì)，在50℃時(shí)蝦青素含量達(dá)到最高;隨后，隨著提取溫度的升高，蝦青素受熱易被氧化降解，致使其含量呈緩慢下降的趨勢(shì)。實(shí)驗(yàn)在綜合考慮各因素的條件下，選擇50℃作為最佳提取溫度。

圖2 提取溫度對(duì)蝦青素提取效果的影響(n=3)Fig.2 Effect of extraction temperature on the extraction result of astaxanthin(n=3)

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)蝦青素提取效果的影響

由圖3可知，在恒溫浸提60 min之前，蝦青素未能充分地轉(zhuǎn)移到溶液中，隨著提取時(shí)間的增加，蝦青素含量呈逐漸上升的趨勢(shì)，在60 min時(shí)蝦青素含量達(dá)到最高;之后，隨著浸提時(shí)間的增加，蝦青素含量呈明顯下降的趨勢(shì)。實(shí)驗(yàn)在綜合考慮各因素的條件下，選擇60 min作為最佳提取時(shí)間。

圖3 提取時(shí)間對(duì)蝦青素提取效果的影響(n=3)Fig.3 Effect of extraction time on the extraction result of astaxanthin(n=3)

2.1.4 料液比對(duì)蝦青素提取效果的影響

由圖4可知，在30～60 mL/g內(nèi)，隨著提取溶劑的增加，蝦青素含量呈逐漸增高，這是因?yàn)槿軇┡c原料間的濃度差越大，就越有利于目標(biāo)物蝦青素的溶出，其提取效率也就越高，當(dāng)料液比為60∶1(mL∶g)時(shí)蝦青素含量達(dá)到最大;隨后，蝦青素含量略有下降，表明提取基本完全。在綜合考慮各因素的條件下，選擇60∶1(mL∶g)作為適合的料液比。

圖4 料液比對(duì)蝦青素提取效果的影響(n=3)Fig.4 Effect of liquid/soild ratio on the extraction result of astaxanthin(n=3)

2.2 響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)結(jié)果及方差分析

利用軟件Design-Expert 7.0進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，本次試驗(yàn)共有17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，分為兩類:其一是析因點(diǎn)，自變量取值在各因素所構(gòu)成的三維頂點(diǎn)，共有12個(gè)析因點(diǎn);其二是零點(diǎn)，為區(qū)域的中心點(diǎn)，零點(diǎn)試驗(yàn)重復(fù)5次，用以估計(jì)試驗(yàn)誤差，并以蝦青素含量為響應(yīng)值。Box-Behnken方案設(shè)計(jì)與響應(yīng)曲面法實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 Box-Behnken方案設(shè)計(jì)與響應(yīng)曲面法實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Design of Box-Behnken experiment and results of response surface methodology

利用Design-Expert 7.0軟件對(duì)表3實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到南極磷蝦蝦青素含量(Y)對(duì)提取溫度(A)、料液比(B)和提取時(shí)間(C)的二次回歸模型為:Y= －473.30+5.54A+14.11B+2.11C+0.007 9AB－0.006 3AC－0.008 3BC－0.055A2－0.11B2－0.010C2。

2.3 模型顯著性檢驗(yàn)

對(duì)上述回歸模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表4。

由表4可知，模型的P＜0.01，表明回歸模型極顯著，可以用模型分析、預(yù)測(cè)南極磷蝦蝦青素提取方法結(jié)果;A、B、C、BC對(duì)蝦青素含量有著顯著影響，A2、B2、C2對(duì)蝦青素含量的影響達(dá)到極顯著水平。由F值可知，各因素對(duì)蝦青素含量的影響次序?yàn)?料液比二次項(xiàng)＞料液比一次項(xiàng)＞溫度二次項(xiàng)＞時(shí)間二次項(xiàng)＞溫度一次項(xiàng)＞時(shí)間一次項(xiàng);此外，從方差分析結(jié)果可知，R2=0.990 3，表明該模型與試驗(yàn)擬合較好。提取溫度、料液比、提取時(shí)間之間的相互作用見(jiàn)圖5～圖7。

通過(guò)軟件分析，得到蝦青素提取的最佳條件為:提取溫度51.41℃、料液比63.13∶1(mL∶g)、提取時(shí)間61.15 min。在此條件下，蝦青素理論含量為179.00 mg/kg。為檢驗(yàn)響應(yīng)曲面法所得結(jié)果的可靠性，采用上述優(yōu)化條件提取蝦青素，考慮到實(shí)際操作的便利，將提取參數(shù)修正為:提取溫度51℃、料液比63 mL/g、提取時(shí)間61 min。在此修正條件下提取得到的蝦青素平均含量為179.21 mg/kg，與理論預(yù)測(cè)值相比，其相對(duì)誤差小于l%。因此，基于響應(yīng)曲面法所得的優(yōu)化提取方法參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)用價(jià)值。

2.4 優(yōu)化條件下提取不同南極磷蝦粉樣品中的蝦青素

實(shí)驗(yàn)分別以市售南極磷蝦粉產(chǎn)品以及大連遼漁集團(tuán)、山東科芮爾公司、青島?？ü咎峁┑哪蠘O磷蝦粉樣品為材料，在上述優(yōu)化條件下分別提取蝦青素，測(cè)得的蝦青素含量見(jiàn)表5。

圖6 提取溫度與提取時(shí)間對(duì)蝦青素含量影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface and contour plots for the interactive effect of extraction temperature and extraction time onastaxanthin content

圖7 料液比與提取時(shí)間對(duì)蝦青素含量影響的響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface and contour plots for the interactive effect of liquid/soild ratio and extraction time onastaxanthin content

表5 優(yōu)化條件下提取所得南極磷蝦粉樣品中的蝦青素含量Table 5 Astaxanthin content of Antarctic krill powder samples under optimized extraction conditions

由表5可以看出，磷蝦粉樣品中的蝦青素含量在42～181 mg/kg，大多數(shù)樣品中的蝦青素含量低于100 mg/kg，分析原因可能是因?yàn)榱孜r粉在生產(chǎn)貯運(yùn)過(guò)程中常暴露于空氣、光照下，其中的蝦青素已被不同程度地氧化降解，致使含量減少［14－15］;同時(shí)從檢測(cè)的結(jié)果還可以看出:即使是同一生產(chǎn)企業(yè)，其不同生產(chǎn)年限的磷蝦粉中的蝦青素含量也有顯著差異，分析原因可能是生產(chǎn)原料和加工工藝不同而使然。

3 結(jié)論

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化南極磷蝦蝦青素的提取條件，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)法進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)并分析處理數(shù)據(jù)，最終通過(guò)響應(yīng)面的分析得出最佳的蝦青素提取條件為:提取溫度51.41℃、料液比63.13∶1(mL∶g)、提取時(shí)間61.15 min，得到的理論含量為179.00 mg/kg。將方法條件修正后，實(shí)驗(yàn)所得的蝦青素含量為179.21 mg/kg。通過(guò)響應(yīng)面的分析結(jié)果可知，影響蝦青素含量的提取因素依次為:料液比＞提取溫度＞提取時(shí)間。同時(shí)，采用分光光度測(cè)定法和美國(guó)FDA提供的公式計(jì)算法能夠快速準(zhǔn)確地測(cè)定、計(jì)算出蝦青素含量，適合于探索性試驗(yàn)的大批量快速進(jìn)行。

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