李垚，徐爾尼，楊欣，胡冰彬

(南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌，330047)

共軛亞油酸(conjugated linoleic acid，CLA)是指一系列含有共軛雙鍵、具有不同位置和空間的十八碳二烯酸同分異構(gòu)體的混合物，其中最具有生理活性的異構(gòu)體是 c9，t11 － CLA 和 t10，c12 － CLA［1］，它們具有多種營養(yǎng)和保健功能，如抗癌、減肥、抗動脈粥樣硬化和延緩機(jī)體免疫力衰退等［2］。乳酸菌細(xì)胞膜上的亞油酸異酶具有將亞油酸轉(zhuǎn)化生成CLA的能力，由于易培養(yǎng)、生成的異構(gòu)體單一、反應(yīng)條件溫和、產(chǎn)量大、安全性高等優(yōu)點(diǎn)，因此使用乳酸菌進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化合成CLA已成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)。

近幾年利用微生物靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化生成CLA為眾多研究者所關(guān)注，這是由于微生物細(xì)胞轉(zhuǎn)化技術(shù)操作簡單，在反應(yīng)體系液中干擾物質(zhì)少，不易染菌，更有利于下游的純化和檢測等優(yōu)點(diǎn)，但尋找更為廉價的轉(zhuǎn)化底物是當(dāng)前重要的研究方向。菜籽油來源廣泛，價格比亞油酸低廉，其中含有約20%的亞油酸，這些亞油酸在乳酸菌亞油酸異構(gòu)酶作用下可轉(zhuǎn)化生成附價值極高的CLA。

本文研究了轉(zhuǎn)化液介質(zhì)、介質(zhì)濃度、pH、溫度、時間、細(xì)胞濃度、金屬離子等因素對嗜酸乳桿菌(Lactibacillus acidophilus)CGMCC 1.1854靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化菜籽油生成CLA的影響，并利用Box-Benhnken中心組合設(shè)計(jì)和響應(yīng)面法對菜籽油轉(zhuǎn)化生成CLA的時間、pH、溫度、細(xì)胞濃度進(jìn)行了工藝條件的優(yōu)化分析，以期達(dá)到提高CLA產(chǎn)量的目的。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌種

嗜酸乳桿菌(Lactibacillus acidophilus)CGMCC 1.1854，來自中國普通微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 試劑

共軛亞油酸標(biāo)準(zhǔn)品 (含有c9，t11和t10，c12兩種異構(gòu)體，純度≥99%)，Sigma公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純;菜籽油(酸價5.05，皂化值185)，來自江西婺源;亞油酸(純度≥98%)，上海試劑一廠;豬胰脂肪酶(酶活≥10 000U/g)，上海博奧生物科技公司。

1.1.3 主要儀器

紫外/可見分光光度計(jì)(751)，上海分析儀器廠;恒溫振蕩器(THZ-C)江蘇太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠;低速大容量離心機(jī)(DL-5-B)上海安亭科學(xué)儀器廠;酸度計(jì)(PHS-25型)等。

1.1.4 MRS培養(yǎng)基

酪蛋白胨10.0 g、牛肉提取物10.0 g、酵母提取物5.0 g、葡萄糖5.0 g、乙酸鈉5.0 g、檸檬酸二胺2.0 g、吐溫 －80 1.0 g、K2HPO42.0 g、MgSO40.2 g、Mn-SO40.05 g、蒸餾水 1.0 L、pH 6.8，121 ℃ 滅菌 20 min。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菜籽油的乳化［3］及水解處理［4］

稱取1.26 g吐溫-80和0.75 g司盤-80，混勻，然后70℃水浴2 min，再加入1.5 g菜籽油，逐漸滴入去離子水，形成油包水型乳化液，至菜籽油終濃度為75 mg/mL。超聲乳化處理(300 W，超聲5 s，間歇3 s，重復(fù)8次)，形成穩(wěn)定的乳濁液，121℃滅菌20 min，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 乳酸菌細(xì)胞的收集

從新鮮斜面挑取1環(huán)活化菌種接到150 mL MRS培養(yǎng)基中，37℃下靜置培養(yǎng)20 h，即為種子液。按5%接種量接種至亞油酸含量為0.2 mg/mL MRS培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖誘導(dǎo)培養(yǎng)，37℃下靜置培養(yǎng)18 h。培養(yǎng)液冷凍離心(4 500×g，25 min，4℃)，去上清液，沉淀細(xì)胞用無菌生理鹽水洗滌1次，離心收集細(xì)胞，稀釋至菌體細(xì)胞濃度為0.25 g/mL。

1.2.3 轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化

在轉(zhuǎn)化介質(zhì)液總體積為30 mL，菜籽油濃度為7.5 mg/mL，脂肪酶［5］的加入量為 2 mg/30 mL 基礎(chǔ)上，將依次對轉(zhuǎn)化液介質(zhì)的成分、介質(zhì)濃度、pH、溫度、時間、細(xì)胞濃度、金屬離子［6］7個因素進(jìn)行研究。

1.2.3.1 轉(zhuǎn)化介質(zhì)及其濃度對CLA產(chǎn)量的影響

以0.1 mol/L pH 7.0的4種不同成分緩沖液作為轉(zhuǎn)化液介質(zhì)，即(1)檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液［7］、(2)Na2HPO4-KH2PO4緩沖液、(3)K2HPO4-KH2PO4緩沖液［8］、(4)KH2PO4-NaOH緩沖液。轉(zhuǎn)化細(xì)胞濃度為30 mg/mL，37 ℃，80 r/min，轉(zhuǎn)化24 h，根據(jù) CLA的生成量確定最適的轉(zhuǎn)化液介質(zhì)。

使用濃度分別為:0.05、0.1、0.15、0.2 mol/L pH 7.0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液為轉(zhuǎn)化介質(zhì)，轉(zhuǎn)化細(xì)胞濃度為30 mg/mL，37 ℃，80 r/min，轉(zhuǎn)化24 h，檢測在不同濃度的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中CLA含量，以確定最適轉(zhuǎn)化液介質(zhì)濃度。

1.2.3.2 轉(zhuǎn)化液介質(zhì)pH對CLA產(chǎn)量的影響

將收集到的細(xì)胞分別用 pH為:5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5 的 0.1 mol/L 檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液進(jìn)行懸浮，細(xì)胞濃度為30 mg/mL，37℃，80 r/min，轉(zhuǎn)化24 h，檢測各個轉(zhuǎn)化液中的CLA含量，確定轉(zhuǎn)化液介質(zhì)的最適pH值。

1.2.3.3 轉(zhuǎn)化溫度對CLA產(chǎn)量的影響

在已確定緩沖液介質(zhì)和pH的轉(zhuǎn)化體系中，細(xì)胞濃度為 30 mg/mL，轉(zhuǎn)化溫度分別為:21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41 ℃，80 r/min，轉(zhuǎn)化 24 h，檢測各個轉(zhuǎn)化液中的CLA含量，確定最適轉(zhuǎn)化溫度。

1.2.3.4 轉(zhuǎn)化時間對CLA產(chǎn)量的影響

在已確定緩沖液介質(zhì)和pH值的轉(zhuǎn)化體系中，細(xì)胞濃度為30 mg/mL，35℃，80 r/min，轉(zhuǎn)化反應(yīng)時間分別為 16、20、24、28、32、36、40、44、48 h，檢測各轉(zhuǎn)化液中的CLA含量，確定最適轉(zhuǎn)化時間。

1.2.3.5 細(xì)胞濃度對CLA產(chǎn)量的影響

在已確定緩沖液介質(zhì)和pH值的轉(zhuǎn)化體系中，將收集到的菌體細(xì)胞加入該體系中，至細(xì)胞終濃度分別為:8、15、20、30、40、50、70、100 mg/mL，35℃，80 r/min，轉(zhuǎn)化24 h，檢測各轉(zhuǎn)化液中的CLA含量，確定最適轉(zhuǎn)化細(xì)胞濃度。

1.2.3.6 金屬離子對CLA產(chǎn)量的影響

一般低濃度的金屬離子會促進(jìn)亞油酸異構(gòu)酶的活性，在已確定的反應(yīng)體系中加入不同種類的金屬離子(Mg2+、Zn2+、Fe2+、Ca2+、Cu2+、Mn2+、Fe3+)，使其濃度分別為1、2 mmol/L，然后檢測各轉(zhuǎn)化液中CLA產(chǎn)量，與未添加金屬離子(H)的對照組轉(zhuǎn)化液中CLA產(chǎn)量比較。

1.2.4 響應(yīng)面法［9］優(yōu)化轉(zhuǎn)化工藝

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，選擇對亞油酸異構(gòu)酶活性有顯著影響的4個因素，即時間、pH值、溫度、細(xì)胞濃度為自變量，以CLA產(chǎn)量為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)出4因素3水平的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，如表1。

表1 各因素水平編碼Table 1 Coding of factors and levels

1.2.5 共軛亞油酸的提取方法［10］

取2 mL轉(zhuǎn)化液放入帶蓋試管中，加入10 mL正己烷，使用快速混勻器混合6 min，然后使用離心機(jī)5 000 r/min離心3 min，分成上中下，3層，用移液槍吸除下層水相，加入2 mL蒸餾水，混勻1 min，洗掉水溶性物質(zhì)，離心分層，棄掉下層水相，然后把剩下的有機(jī)相和乳化層使用裝有無水硫酸鈉的濾紙過濾、吸水干燥，定容至25 mL容量瓶中。

1.2.6 共軛亞油酸的檢測方法［11］

準(zhǔn)確稱取共軛亞油酸標(biāo)準(zhǔn)品，用正己烷溶解，配制成梯度溶液，在室溫25℃下，以正己烷為參比溶液，檢測233 nm處吸光值，以CLA濃度為橫坐標(biāo)，吸光值A(chǔ)233為縱坐標(biāo)，建立CLA紫外檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)系數(shù)是0.999 5，為高度顯著，線性范圍是 1 ～7 μg/mL，檢測限 1 μg/mL;將從轉(zhuǎn)化液中提取到的正己烷溶液，以正己烷為參比，在紫外233 nm處檢測吸光值，然后按照標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出CLA含量。

圖1 CLA紫外標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of CLA UV absorbance

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)化液介質(zhì)及其濃度對CLA產(chǎn)量的影響

選用了4種不同成分緩沖液作為轉(zhuǎn)化液介質(zhì)，即(1)檸 檬 酸-檸 檬 酸 鈉 緩 沖 液［7］;(2)Na2HPO4-KH2PO4緩沖液;(3)K2HPO4-KH2PO4緩沖液［8］、(4)KH2PO4-NaOH緩沖液。由圖2可以看出，最適轉(zhuǎn)化介質(zhì)是檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，CLA的生成量為104.78±6.2 μg/mL，這說明適量的Na+對嗜酸乳桿菌的亞油酸異酶活性有促進(jìn)作用。圖3結(jié)果顯示，最適介質(zhì)液濃度是0.1 mol/L，是由于離子濃度過低不適合進(jìn)行酶反應(yīng)，而高濃度的鹽溶液，則會產(chǎn)生破乳現(xiàn)象，使菜籽油和水乳化不夠充分，影響了酶反應(yīng)。

圖2 轉(zhuǎn)化介質(zhì)對CLA產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of conversion medium on the yield of CLA

2.2 轉(zhuǎn)化液介質(zhì)pH對CLA產(chǎn)量的影響

由圖4可以看出，嗜酸乳桿菌亞油酸異構(gòu)酶在5.0 ～8.5 之間都有酶活性，這和 Keper［12］等的報(bào)道基本一致。Lin［13］等對嗜酸乳桿菌亞油酸異構(gòu)酶的研究表明，酶在pH 5時活性最大。圖4結(jié)果顯示，酶雖在pH 5時有活性峰值，但最適pH值是6.5，CLA的生成量為191.31±2.6 μg/mL，可能與本文使用的乳酸桿菌靜息細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，底物是菜籽油而不是亞油酸有關(guān)。

圖3 介質(zhì)濃度對CLA產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of medium concentration on the yield of CLA

圖4 pH對CLA產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of pH on the yield of CLA

2.3 轉(zhuǎn)化溫度對CLA產(chǎn)量的影響

從圖5可以看出，適宜的轉(zhuǎn)化溫度在31～35℃之間，其中35℃為最佳溫度，CLA的生成量221.83±6.1 μg/mL。在20～30℃之間酶活力變化不大，超過40℃酶活嚴(yán)重失活，表明亞油酸異構(gòu)酶熱穩(wěn)定性差，這和曹建［14］等人的研究結(jié)果基本一致。

圖5 溫度對CLA產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of Temperature on the yield of CLA

2.4 轉(zhuǎn)化時間對CLA產(chǎn)量的影響

由圖6結(jié)果顯示，初始隨著轉(zhuǎn)化時間的延長，CLA產(chǎn)量不斷增加，當(dāng)轉(zhuǎn)化至24h時，CLA產(chǎn)量達(dá)223.57±5.72 μg/mL，隨著時間的延長，產(chǎn)量開始減少。這是由于CLA易氧化、穩(wěn)定性不高會造成產(chǎn)量的下降，因此，24 h是最適的轉(zhuǎn)化時間。

2.5 細(xì)胞濃度對CLA產(chǎn)量的影響

從圖7可以看出，當(dāng)細(xì)胞濃度達(dá)到40 mg/mL時，CLA的產(chǎn)量趨于穩(wěn)定，達(dá)到232.04±5.27 μg/mL，細(xì)胞濃度與菜籽油濃度(7.5 mg/mL)最適比例為 5.3∶1。

圖7 細(xì)胞濃度對CLA產(chǎn)量的影響Fig.7 Effect of cell concentration on the yield of CLA

2.6 金屬離子對CLA產(chǎn)量的影響

一般低濃度的金屬離子會促進(jìn)亞油酸異構(gòu)酶的活性，在反應(yīng)體系中加入不同種類的金屬離子(Mg2+、Zn2+、Fe2+、Ca2+、Cu2+、Mn2+、Fe3+)，使其濃度分別為 1、2 mmol/L。結(jié)果如圖 8所示，1 mmol/L Ca2+和Cu2+對亞油酸異構(gòu)酶活性有微弱促進(jìn)作用，分別比對照組提高了0.35%和0.62%。2 mmol/L Zn2+和 Ca2+對亞油酸異構(gòu)酶活性有較大促進(jìn)作用，分別比對照組提高了2.40%和1.75%。Mg2+作用不明顯，F(xiàn)e2+、Mn2+和Fe3+都表現(xiàn)出了抑制作用，F(xiàn)e3+的抑制作用最強(qiáng)。Cu2+一般是酶活性的抑制劑，而1 mmol/LCu2+對酶活性起到促進(jìn)作用，可能原因是微量Cu2+可以大幅度促進(jìn)菜籽油水解，有利于酶反應(yīng)的進(jìn)行，2 mmol/L Cu2+則明顯起到了抑制作用。

圖8 金屬離子對CLA產(chǎn)量的影響Fig.8 Effect of metal ion on the yield of CLA

2.7 轉(zhuǎn)化工藝的優(yōu)化

試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Experimental design and results

以CLA產(chǎn)量(Y)為響應(yīng)值，運(yùn)用Design－Expert 8.0.6對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)式回歸分析，得到如下二次多項(xiàng)式:

Y=332.04+22.75A－13.42B+5.75C+5.42D+29.97AB+9.54AC－19.34AD－10.53BC+13.60BD+15.86CD－68.92A2－42.73B2－11.71C2－35.42D2。

回歸模型方差分析表如表3所示。

表3 回歸模型方差分析表Table 3 Analysis of variance for regression equation

由回歸方程和回歸模型方差分析表3可以看出，此模型的 F值是 43.66，“Prob＞F”的 P值小于0.0001，表明該模型是有顯著性意義的，能較好的解釋CLA產(chǎn)量的變化，失擬項(xiàng)在P=0.05水平上不顯著(P=0.242 2＞0.05)。在所選的因素內(nèi)，對CLA產(chǎn)量影響排序?yàn)?時間＞pH＞溫度＞細(xì)胞濃度。交互項(xiàng)AB、AD是極顯著性因子，AC無顯著性差異，說明時間和溫度沒有交互作用。由表4可看出，預(yù)測擬合度十分接近校正擬合度，說明模型是合理的，信噪比大于4為理想值，本模型信噪比是25.788，說明比值理想，本模型方程可以被用來解釋設(shè)計(jì)方案。

表4 數(shù)學(xué)模型的統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table 4 Statistical results of regression model

2.8 響應(yīng)面圖分析和最優(yōu)轉(zhuǎn)化工藝的確定

回歸方程AB、AD交互項(xiàng)所做的響應(yīng)面圖。

圖9 響應(yīng)面圖分析Fig.9 The chart of response surface analyse

兩個圖的響應(yīng)曲面都有著明顯的坡度，說明pH與時間，細(xì)胞濃度與時間都有著明顯的交互作用，這和回歸方程分析中的結(jié)果一致。

通過軟件分析給出最優(yōu)方案和CLA產(chǎn)量預(yù)測值。最優(yōu)轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化工藝:A=25.2 h，B=6.36，C=36.78℃，D=42.16 mg/ml，在此條件下CLA產(chǎn)量的理論值是236.26 μg/ml，考慮到實(shí)際操作和CLA易氧化的情況，實(shí)際實(shí)驗(yàn)中最優(yōu)條件控制在A=25 h，B=6.5，C=36 ℃，D=40 mg/mL，在此條件下，通過 5次獨(dú)立的試驗(yàn)，得到的CLA產(chǎn)量的實(shí)際值為230.12±7.52 μg/mL，試驗(yàn)值與預(yù)測值擬合較好，說明回歸方程為轉(zhuǎn)化合成CLA提供了一個合適的模型，驗(yàn)證了前述假定的可行性。

3 結(jié)論

本論文在菜籽油濃度為7.5 mg/mL，脂肪酶的加入量為2 mg/30 mL條件下，對嗜酸乳桿菌靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化菜籽油生成CLA條件進(jìn)行了優(yōu)化研究。通過單因素試驗(yàn)，確定了最適轉(zhuǎn)化液介質(zhì)是0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，得到了最適pH、溫度、轉(zhuǎn)化時間和細(xì)胞濃度參數(shù)。同時，研究了不同金屬離子對亞油酸異構(gòu)酶活性的影響，1 mmol/L Ca2+和 Cu2+對亞油酸異構(gòu)酶活性有微弱促進(jìn)作用，分別比對照組提高了0.35%和0.62%。2 mmol/L Zn2+和 Ca2+對亞油酸異構(gòu)酶活性有較大促進(jìn)作用，分別比對照組提高了2.40%和1.75%。在該基礎(chǔ)上，利用Box-Benhnken中心組合設(shè)計(jì)和響應(yīng)面法對轉(zhuǎn)化時間、pH值、溫度、細(xì)胞濃度進(jìn)行了工藝優(yōu)化分析，確定了最優(yōu)轉(zhuǎn)化時間25 h，pH6.5，溫度36℃，細(xì)胞濃度40 mg/mL。在此優(yōu)化條件下，CLA的產(chǎn)量可以達(dá)到(230.12±7.52)μg/mL。通過這個數(shù)據(jù)可以看出嗜酸乳桿菌轉(zhuǎn)化菜籽油生成CLA是可行的，但CLA產(chǎn)量還有待于提高。今后我們可以通過誘變育種、細(xì)胞透性處理、酶激活劑等方法進(jìn)行深入研究，使CLA產(chǎn)量更高。同時，結(jié)合固定化技術(shù)使細(xì)胞態(tài)的亞油酸異構(gòu)酶可以得到重復(fù)、多批次利用，達(dá)到高效率、低成本生產(chǎn)的目的。另外，結(jié)合紅外光譜法，高效液相色譜法，氣相色譜法和質(zhì)譜分析法，對CLA異構(gòu)體和含量進(jìn)一步分析，確定活性異構(gòu)體的含量，為我們以后的研究奠定基礎(chǔ)。

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