龍梅?謝孟峽?劉媛

摘 要 應(yīng)用熒光光譜方法對丁香酸與魚精DNA的相互作用機(jī)理進(jìn)行研究，當(dāng)加入魚精DNA后丁香酸的內(nèi)源性熒光發(fā)生明顯猝滅，結(jié)果表明在DNA與丁香酸濃度比在4≤CfsDNA/CSY ≤ 32范圍內(nèi)，計算其stern-volmer 猝滅速率常數(shù)為1.52×1012 L·mol-1·s-1，屬靜態(tài)猝滅機(jī)理，說明二者之間形成復(fù)合物。根據(jù)靜態(tài)猝滅理論研究發(fā)現(xiàn)結(jié)合丁香酸與DNA之間的結(jié)合比為1：1，常數(shù)為K fsDNA/SY = 1.85×104 L·mol-1，二者結(jié)合使得丁香酸分子結(jié)構(gòu)發(fā)生一定程度改變。

關(guān)鍵詞 熒光猝滅 魚精DNA 丁香酸

引 言

DNA作為生物遺傳物質(zhì)，是生物體內(nèi)主要的生物大分子之一，同時也是眾多藥物的主要標(biāo)靶。藥物進(jìn)入體內(nèi)后與DNA的相互作用，會影響DNA本身的復(fù)制和合成等性質(zhì)，因而小分子藥物與DNA相互作用研究近年來越來越受到人們重視[[1，2]。有機(jī)酸是中藥中的一大類有效成份，同時也廣泛分布在植物、水果和蔬菜中，它們與生物大分子的相互作用日益受到關(guān)注[3～5]。Sroka[6]等研究多酚酸的抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)羥基數(shù)多的多酚酸抗氧化活性要大于羥基數(shù)少的多酚酸。丁香酸屬于苯甲酸衍生物，經(jīng)常在板藍(lán)根等一些植物的提取液中找到，具有消炎、抗菌、抗氧化等作用[7]。

圖1 丁香酸 syringic acid

對小分子藥物與DNA相互作用的研究近年來已經(jīng)成為生物、化學(xué)等眾多領(lǐng)域的研究熱點問題之一，該領(lǐng)域的研究有助于人們從分子水平認(rèn)識藥物DNA相互作用方式，對于研究小分子的生物活性及藥物作用機(jī)理、對以DNA為靶標(biāo)的藥物分子篩選和設(shè)計等都有重要意義。本文通過熒光光譜法研究丁香酸和魚精DNA的相互作用，判定二者相互作用形成復(fù)合物，并計算出結(jié)合常數(shù)，為從分子水平認(rèn)識丁香酸與DNA的相互作用提供重要信息。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

熒光光譜儀，法國JY公司 Fluorolog-TAU-3 熒光光譜儀。

試劑：魚精DNA（Fish sperm DNA，fsDNA）（北京鼎國生物技術(shù)有限公司，Sigma公司分裝）；丁香酸（純度≥97%）（sigma公司）； NaH2PO4（北京紅星化工廠，分析純）；NaOH（分析純，北京化學(xué)試劑公司）；實驗用水為Milli-Q超純水。

溶液配制：配置0.02 mol?L-1NaH2PO4緩沖液溶解，用NaOH調(diào)節(jié)pH為7.4，所有的魚精DNA和丁香酸溶液均用該緩沖溶液配置。熒光光譜測量中魚精DNA的濃度以ε260 = 6600L?mol-1?cm-1確定[8]，測定二者相互作用光譜時保持丁香酸濃度為10-5mol?L-1；加入DNA溶液和藥物具有一系列濃度比例，C fsDNA /C藥物依次為0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0。

1.2 實驗內(nèi)容

熒光光譜測量：以280nm為激發(fā)波長，記錄300～500nm范圍內(nèi)丁香酸及其與一系列不同濃度fsDNA混合溶液的熒光發(fā)射光譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 丁香酸與DNA相互作用前后的熒光光譜特征

通常情況下丁香酸的紫外吸收光譜在190-350nm范圍內(nèi)主要有3個吸收帶，位于190-230nm處的強(qiáng)吸收帶屬于K吸收帶，位于230-270nm處的較弱吸收帶是B吸收帶，以及位于270-310nm處的較弱吸收帶屬于R吸收帶。K吸收帶的波長、強(qiáng)度與共軛體系的數(shù)目、位置、取代基的種類有關(guān)。從結(jié)構(gòu)上看，由于有助色團(tuán)-OH、-OCH3的影響，SY在204-210nm吸收峰是苯骨架結(jié)構(gòu)E2和K的合并吸收帶；受溶劑磷酸緩沖液極性和取代基的影響，SY的B吸收帶精細(xì)結(jié)構(gòu)消失，形成一個寬峰；溶劑極性大使n→π*吸收帶藍(lán)移，助色團(tuán)-OH、-OCH3使吸收帶紅移，兩種作用的影響使SY的R吸收帶消失，與B吸收帶合并成一個寬峰。

DNA分子具有吸收250–280nm波長紫外光的特性，其吸收峰值在260nm左右，在280nm處吸收值很小，對于丁香酸本身的熒光發(fā)射幾乎不造成干擾。因此選擇DNA做猝滅劑，以280nm為熒光激發(fā)波長，通過丁香酸熒光發(fā)射峰的變化可以研究DNA與藥物的相互作用。

pH 7.4的磷酸緩沖液中，280nm激發(fā)波長下，丁香酸在351nm處有較強(qiáng)的熒光發(fā)射峰。魚精DNA（fsDNA）的紫外光譜的最大吸收在260nm左右，在280nm激發(fā)波長下，在370nm左右有弱的熒光發(fā)射峰（見圖1）。當(dāng)藥物分子與fsDNA發(fā)生相互作用時，藥物熒光發(fā)射強(qiáng)度被明顯的猝滅，其猝滅程度隨fsDNA濃度的增加而增大（見圖1）。這種藥物熒光發(fā)射峰的強(qiáng)度被DNA明顯猝滅的現(xiàn)象能夠直觀地說明二者之間發(fā)生了相互作用。但是這種相互作用，僅僅是由于分子間碰撞引起的靜態(tài)猝滅，還是二者之間發(fā)生相互結(jié)合而引起的動態(tài)猝滅，這還需要進(jìn)一步研究驗證。

2.2 DNA對藥物的熒光猝滅參數(shù)研究

2.2.1 速率常數(shù) 熒光猝滅的機(jī)制有動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅之分，通過判定猝滅機(jī)制可以明確地判定出藥物與DNA分子之間是否發(fā)生了相互的結(jié)合，對于研究藥物小分子與生物大分子之間的相互作用機(jī)制具有重要的意義。一般來說各類猝滅劑對熒光發(fā)色團(tuán)的最大動態(tài)擴(kuò)散猝滅常數(shù)kQ為2.0×1010 L?mol-1?s-1，如果kQ小于該猝滅常數(shù)，則猝滅機(jī)理主要是動態(tài)猝滅；當(dāng)kQ大于該猝滅常數(shù)，說明猝滅機(jī)理包括靜態(tài)猝滅[9]。如果kQ大于最大動態(tài)擴(kuò)散常數(shù)2-3個數(shù)量級，則主要為靜態(tài)猝滅機(jī)理。

如果熒光分子與猝滅劑之間發(fā)生的是動態(tài)猝滅，那么它們應(yīng)該服從Stern-Volmer方程[10]：

（1）

其中F0、F分別藥物與猝滅劑作用前后的熒光強(qiáng)度，[Q]為猝滅劑濃度，τ0為猝滅劑不存在時熒光體的壽命，KQ為雙分子猝滅過程速率常數(shù)，KD為Stern-Volmer常數(shù)。從方程可以看出，用猝滅劑濃度[Q]對F0/F作圖應(yīng)該成線性，根據(jù)直線的斜率即可計算出KD，進(jìn)而可以計算得到熒光猝滅速率常數(shù)KQ。

根據(jù)Stern-Volmer方程，計算出丁香酸與fsDNA相互作用的猝滅速率常數(shù)。從圖2中看出，在實驗濃度范圍內(nèi)，F(xiàn)0/F與fsDNA濃度[Q]之間并不完全呈線性關(guān)系，在較高濃度時向上彎曲。首先在4≤C fsDNA /CSY≤32范圍內(nèi)二者是直線關(guān)系，根據(jù)直線的斜率可以計算出fsDNA對SY的熒光猝滅速率常數(shù)為1.52×1012L?mol-1?s-1，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于動態(tài)猝滅的最大擴(kuò)散猝滅常數(shù)2.0×1010 L?mol-1?s-1，說明在該濃度范圍內(nèi)，fsDNA對丁香酸的熒光猝滅主要為靜態(tài)猝滅機(jī)理，也就是說此時fsDNA與藥物分子之間相互結(jié)合形成了不發(fā)熒光的基態(tài)復(fù)合物。當(dāng)fsDNA濃度進(jìn)一步升高時，Stern-Volmer曲線向上彎曲，說明此時fsDNA對丁香酸的熒光猝滅已經(jīng)不符合動態(tài)猝滅機(jī)理，這是因為任何化學(xué)反應(yīng)中反應(yīng)物之間都存在特定的比例，而fsDNA的濃度已經(jīng)大大超出二者結(jié)合的比例，在其對丁香酸的熒光猝滅中除動態(tài)猝滅還存在諸如靜態(tài)猝滅、非輻射能量轉(zhuǎn)移等多種猝滅機(jī)理共存。

2.2.2 結(jié)合常數(shù) 從上文的分析中可以看到，在4≤C fsDNA /CSY≤32濃度范圍內(nèi)，fsDNA對丁香酸的熒光猝滅符合靜態(tài)猝滅機(jī)理，根據(jù)靜態(tài)猝滅理論[11]即

（2）

以lg（（F0-F）/F）對lg[Q]作圖，便可求得藥物與fsDNA分子的結(jié)合常數(shù)KA和結(jié)合數(shù)n。

丁香酸與fsDNA的結(jié)合位點數(shù)通過lg（F0-F/F）=lgKa+nlg[Q]進(jìn)行線性回歸，見圖3，根據(jù)直線斜率計算可得n=1.15（R=0.995），n近似為1說明丁香酸與fsDNA堿基之間形成1：1的復(fù)合物。同時根據(jù)圖3中直線的截距，計算丁香酸與fsDNA之間的結(jié)合常數(shù)K fsDNA/SY = 1.85×104 L?mol-1。

圖4 丁香酸熒光猝死雙導(dǎo)數(shù)曲線

注：λex=280nm，T=25℃.

通過熒光猝滅光譜、結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點數(shù)可以揭示熒光發(fā)色基團(tuán)與DNA相互作用的方式。從圖2中仔細(xì)觀察可以看到，fsDNA不僅使SY的熒光強(qiáng)度發(fā)生猝滅，而且熒光發(fā)射峰也有紅移現(xiàn)象，說明在fsDNA作用下，二者結(jié)合使得SY的微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，這可能是藥物與fsDNA之間發(fā)生嵌插結(jié)合的結(jié)果。fsDNA有A-DNA的結(jié)構(gòu)特征，在其雙螺旋鏈上有深而狹的大溝和寬而淺的小溝；其在生理pH值的條件下帶有大量負(fù)電荷，在溶液中的DNA分子內(nèi)也有一部分氫鍵被打開，而且打開的部位處于不斷的變化之中，堿基對氫鍵上的質(zhì)子也會不斷地與介質(zhì)中的質(zhì)子發(fā)生交換。丁香酸分子中-COOH上面的H+與fsDNA中的負(fù)電荷結(jié)合進(jìn)而嵌插到fsDNA寬而淺的小溝中，并進(jìn)一步與堿基對氫鍵上的質(zhì)子發(fā)生交換，形成復(fù)合物有較大的平面結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致熒光吸收峰紅移。

3 結(jié)論

通過fsDNA與丁香酸分子的熒光猝滅研究發(fā)現(xiàn)，在二者的濃度比例低于32范圍內(nèi)，該猝滅過程主要是靜態(tài)猝滅機(jī)理，二者之間能過發(fā)生相互作用，形成1：1復(fù)合物，計算所得結(jié)合常數(shù)K fsDNA/SY = 1.85×104 L?mol-1。在丁香酸的熒光猝滅同時，其熒光發(fā)射峰還發(fā)生一定的紅移，說明丁香酸分子有可能嵌入fsDNA分子的小溝中，使得其分子結(jié)構(gòu)平面性加大。當(dāng)fsDNA濃度進(jìn)一步增加，二者濃度比超出32之后，其對于緩沖液中丁香酸的熒光猝滅機(jī)理變得更為復(fù)雜，多種猝滅機(jī)理共存。

參考文獻(xiàn)

[1] 胡亞敏，王興明，費丹， 等. 熒光光譜法研究核黃素與鯡魚DNA的相互作用[J]. 化學(xué)學(xué)報，2008，10（66）：1245-1251.

[2] 周慶華，楊頻. 1，3-雙（2-苯并咪唑基）-2-氧雜丙烷與鋅配合物的合成、晶體結(jié)構(gòu)及其與DNA作用方式的研究[J]. 化學(xué)學(xué)報，2006，64：793-798.

[3] 龍梅，謝孟峽，劉媛. 熒光法研究咖啡酸及其衍生物與溶菌酶的相互作用[J]. 北京師范大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2010，12，46（6）：704-707.

[4] Koshihara Y， Neichi T， Murota S. Caffeic acid is a selective inhibit or for leukotriene biosyntheisi [J]. Biochim Biophys Acta， 1984，792： 92-97.

[5] 張蓉，李淑賢，崔礪，等. 紫莖澤蘭中綠原酸提取工藝的研究[J]. 北京師范大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2008，44（6）：610-613.

[6] Sroka Z，Cisowski W， Hydrogen peroxide scavenging， antioxidant and anti-radical activity of some phenolic acids[J]. Food and Chemical Toxicology，2003，41（6）： 753-758.

[7] 劉云海，方建國，貢雪芃，等. 板藍(lán)根中丁香酸的抗內(nèi)毒素作用[J]. 中草藥，2003，10（34）：65-67.

[8] Xie MX，Xu XY， Wang YD. Interaction between hesperetin and human serum albumin revealed by spectroscopic methods[J]. Biochim. Biophys. Acta ， 2005， 1724： 215-224.

[9] Xie MX， Long， M， Liu， Y， et al. Characterization of the interaction between human serum albumin and morin[J]. Biochim. Biophys. Acta， 2006， 1760：1184-1191.

[10] 王東冬， 孟慶翔， 陳丹丹， 等. 光譜法研究EGCG—Cu（Ⅱ）與ctDNA的相互作用[J]. 光譜學(xué)與光譜分析，2007 ， 27（3） ： 510-513.

[11] 謝孟峽，蔣敏，李崧，等. β-1，2，3，4，6-O-倍酰-D-葡萄糖與人血清白蛋白的相互作用研究[J]. 化學(xué)學(xué)報，2004， 62： 1460-1466.