吳夢瑤?謝宇鋒?陶敏

摘 要 Wnt信號傳導(dǎo)通路是廣泛存在于真核生物中一條高度保守的信號通路，β-連環(huán)蛋白（β-catenin）是Wnt信號通路中的關(guān)鍵調(diào)控因子，通路中的效應(yīng)因子在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移和增殖凋亡過程中發(fā)揮重要作用。Wnt/β-catenin信號通路與胰腺癌關(guān)系密切，并在腫瘤形成的不同階段發(fā)揮不同的作用，抑制此通路能起到抗腫瘤作用，有可能成為候選的靶向治療靶點，值得進一步研究。本文就Wnt/β-catenin通路的信號傳導(dǎo)途徑及其在胰腺癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用作一綜述。

關(guān)鍵詞 Wnt β-catenin 胰腺癌

Wnt是一種作用于動物發(fā)育過程中多個階段的分泌型糖蛋白，哺乳動物基因組中共有19種Wnt信號基因。Wnt信號通路可分為經(jīng)典的Wnt信號途徑（canonical Wnt/β-catenin pathway）與非經(jīng)典的Wnt信號途徑（noncanonical Wnt/β-catenin pathway）2種類型。經(jīng)典的Wnt信號途徑以Wnt配體與跨膜受體卷曲蛋白（Frizzled）和輔助性受體低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6（LRP-5/6）2種受體的結(jié)合為起始點，最終導(dǎo)致β-catenin在細胞質(zhì)中積聚入核后與核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子T細胞因子（TCF）/淋巴樣增強因子（LEF）結(jié)合形成復(fù)合體，調(diào)控靶基因的表達。

1 Wnt/β-catenin信號通路及其生物學(xué)作用

1.1 Wnt/β-catenin信號通路的組成

目前認為Wnt/β-catenin信號通路主要由以下幾種蛋白構(gòu)成：Wnt、Frizzled（FZD）、β-catenin、LRP5/6、松散蛋白（Dsh）、酪蛋白激酶I（CKl）、結(jié)直腸腺瘤性息肉蛋白（APC）、糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）、軸蛋白（Axin）、TCF/ LEF和泛素蛋白（Ub）等。哺乳動物中存在的10種FZD受體蛋白都是7次跨膜受體，并且有較大的胞外N末端富半胱氨酸區(qū)（CRD），能夠提供Wnt結(jié)合的主區(qū)域[1]。CRD有多個結(jié)合層面，其中一個包含能與Wnt分子相互作用的疏水凹槽。Wnt信號通路激活時，Wnt蛋白結(jié)合一個FZD蛋白與LRP5/6蛋白組成的異源二聚體受體復(fù)合物，最終導(dǎo)致β-catenin在胞質(zhì)中積累并轉(zhuǎn)運到細胞核[2]，核中TCF與β-catenin結(jié)合后轉(zhuǎn)化為TCF/β-catenin轉(zhuǎn)錄激活因子，最終啟動WNT信號通路下游特異性靶基因的轉(zhuǎn)錄[3、4]。當 FZD/LRP受體未被結(jié)合時，胞質(zhì)中β-catenin與GSK-3β、APC、CKl和Axin構(gòu)成一個多蛋白復(fù)合物。β-catenin的Ser33/Ser37/Thr41位點受到GSK-3β磷酸化后立即被蛋白酶體泛素化降解，使其保持在一個較低水平。β-catenin的Tyr654位點磷酸化后，C末端更易被眾多轉(zhuǎn)錄共激活因子綁定而促進轉(zhuǎn)錄，這些轉(zhuǎn)錄共激活因子是常規(guī)[6]。β-catenin在細胞質(zhì)與細胞核之間穿梭的細節(jié)仍不清楚，不過最近有研究證明微管的作用和主動運輸與其相關(guān)[7]。還有研究表明β-catenin會瞬時有序地與不同的核孔成分結(jié)合以順利通過核孔，在這些成分中Nup358對于β-catenin在核易位過程中與核孔的對接與斷連尤其重要[8]。TCF根據(jù)不同的細胞內(nèi)環(huán)境產(chǎn)生促進或抑制靶基因的作用[9]。昆蟲的基因組只編碼一種TCF，而脊椎動物中則有4種，TCF1、TCF3、TCF4、LEF1，它們都能與β-catenin發(fā)生反應(yīng)，在脊椎動物中存在的剪接變異體使情況更為復(fù)雜[4]。在脊椎動物中，有的TCF更傾向于阻遏Wnt/β-catenin的靶基因，而更多的則是激活劑[10]。近期有研究認為蛋白質(zhì)Jerky/Earthbound能調(diào)節(jié)β-catenin-TCF活性，且具有細胞類型特異性[11]。除TCF外β-catenin也能結(jié)合各種其他轉(zhuǎn)錄因子并誘導(dǎo)其靶基因的轉(zhuǎn)錄，例如在小鼠胚胎干細胞中，β-catenin能夠與多能性轉(zhuǎn)錄因子Oct4結(jié)合而誘導(dǎo)其下游靶基因的轉(zhuǎn)錄[4]。

Lyashenko等研究證明β-catenin的生物學(xué)功能取決于它在信號通路和組織學(xué)結(jié)構(gòu)上的雙重角色。缺乏β-catenin的小鼠胚胎干細胞無法分化出中胚層胚葉，并且無法形成神經(jīng)上皮，兩者都會影響到分化過程中細胞與細胞間的連接，而重新加入β-catenin后細胞間粘附點得到了修復(fù)，神經(jīng)上皮組織也可繼續(xù)形成，但中胚層的形成無法恢復(fù)，因為其需要實現(xiàn)完整的β-catenin轉(zhuǎn)錄過程[12]。在背神經(jīng)管和神經(jīng)嵴細胞的發(fā)育過程中，β-catenin的缺失會比僅僅抑制其表達造成更明顯的表型，進一步證明β-catenin的作用會產(chǎn)生疊加效應(yīng)[13]。

1.2 Wnt信號通路和干細胞自我復(fù)制

WNT通路在維持干細胞方面的作用已引起廣泛的關(guān)注。干細胞是一類具有自我復(fù)制能力的多潛能細胞，在一定條件下它可以分化成多種功能細胞，這主要取決于外界的細胞信號，這些信號包含能夠短期限制干細胞數(shù)量的信號中心[14]。

已有研究證明Wnt是干細胞的關(guān)鍵信號，在胃腸、皮膚、毛囊和乳腺等器官中都發(fā)現(xiàn)事先標記過的干細胞[15、16]。世系追蹤技術(shù)證實Wnt是多種成體干細胞的自我復(fù)制信號蛋白，Wnt蛋白或Wnt信號通路激動劑可維持干細胞的生長。早期有研究表明小鼠TCF4突變導(dǎo)致腸干細胞的損傷，隨后出現(xiàn)組織的分解。毛囊中的Wnt信號通路在干細胞和祖細胞生物學(xué)中起到多重作用。表達DKK以阻斷Wnt信號通路后，毛囊和乳腺等其他皮膚附屬結(jié)構(gòu)的組織特異性干細胞受到很大程度的損失。相反，在造血和毛囊系統(tǒng)中激活Wnt信號通路均可導(dǎo)致干細胞的擴增[17]。Wnt通路激動劑R-Spondin可以維持干細胞的自我更新狀態(tài)以分化出腸上皮細胞[18]。Ten Berge 等[19]發(fā)現(xiàn)Wnt可以維持小鼠胚胎干細胞的多能性。因此Wnt對于退化性疾病的治療有一定臨床意義。

1.3 WNT通路抑制劑通過多種途徑作用于WNT受體

Wnt/β-catenin能受到多種因素的調(diào)節(jié)，其中有分泌型Frizzled相關(guān)蛋白（sFRPs）和Wnt抑制蛋白（WIF），兩者都能與Wnt結(jié)合從而競爭性抑制Wnt和FZD/LRP受體的結(jié)合。其他Wnt抑制劑包括Dickkopf（DKK）和WISE/SOST家族蛋白，能夠結(jié)合LRP5/6而拮抗信號通路的傳導(dǎo)。此外還有一種膜結(jié)合糖蛋白APCDD1能夠分別與Wnt和LRP結(jié)合從而削弱Wnt信號傳導(dǎo)通路。

1.4 Wnt信號通路和腫瘤

早期研究將Wnt通路與乳腺癌和結(jié)腸癌聯(lián)系起來，并證明Wnt信號通路的激活會促進腫瘤的起始和發(fā)展。隨后有研究證明最初設(shè)想過于簡單，Wnt通路在不同環(huán)境中對于腫瘤的形成起到不同的作用，不能僅用單一的機制來解釋。APC突變造成的遺傳性腫瘤病變被稱為家族性腺瘤性息肉?。‵AP）。FAP患者攜帶雜合子APC基因突變，第二個等位基因在能成長為結(jié)腸腺瘤、息肉的個體細胞中經(jīng)常丟失，KRAS、TP53和Smad4等其他的基因突變會誘發(fā)這些息肉的惡變。大多數(shù)散發(fā)性大腸癌源于APC等位基因的缺失，造成β-catenin和TCF家族成員TCF4復(fù)合物的形成。近期全球的全基因組外顯子測序已證實，絕大多數(shù)大腸癌患者基因組中存在APC突變[20]。此外還揭示編碼TCF4的基因VTl1A 和Tcf7l2罕見但周期性出現(xiàn)的融合現(xiàn)象，使結(jié)腸癌的癌基因列表又增添一位Wnt信號通路成員[21]。

2 Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)因素在胰腺癌中的表達水平

Wnt信號通路多方面調(diào)節(jié)胰腺癌的生物學(xué)特性，通路活性在胰腺癌中普遍上升，胰腺癌細胞表達多種Wnt配體[22]，在大部分人類胰腺腫瘤中都發(fā)現(xiàn)Wnt信號通路構(gòu)成因子突變。除經(jīng)典的Wnt信號通路，非經(jīng)典的Wnt信號通路也在胰腺癌中起到重要作用[23、24]，不同的Wnt通路的重要性還需要進一步研究。

越來越多的證據(jù)表明Wnt/β-catenin信號通路在胰腺癌中的作用隨著病程、位置、作用強度、激活機制的不同而發(fā)生改變，有時甚至?xí)韵嗝?。?catenin在正常胰腺發(fā)育過程中是必不可少的，但在成人胰腺中表達下調(diào)?；驕y序技術(shù)證明胰腺癌有大量高度易變的基因改變，這些基因改變與Wnt信號通路等所有腫瘤共有的12條通路相關(guān)。海澤等已經(jīng)證明，Wnt/β-catenin通路的上調(diào)可以誘導(dǎo)胰腺癌發(fā)生。Qiao等發(fā)現(xiàn)β-catenin參與胰腺癌的發(fā)生，其胞膜表達減弱、胞質(zhì)的異位表達均與胰腺癌的預(yù)后緊密相關(guān)。相反，Lowy等研究發(fā)現(xiàn)β-catenin在胰腺癌細胞中表達下調(diào)而不是上調(diào)。Heiser等研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠體內(nèi)持續(xù)活化β-catenin可導(dǎo)致胰腺上皮內(nèi)瘤變（PanIN）及最終腫瘤形成。Zhang Y等[25]發(fā)現(xiàn)抑制Wnt通路會顯著延遲胰腺上皮內(nèi)瘤變的形成。3-Cl-AHPC能抑制β-catenin在胰腺癌細胞中的表達[26]。SOX15 （sex determining region Y—box 15）也能抑制Wnt/β-catenin通路，從而在胰腺癌中起到腫瘤抑制因子的作用[27]。Ripka等研究認為Wnt通路增強了胰腺癌細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移活性，參與胰腺癌細胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程。調(diào)節(jié)EMT的轉(zhuǎn)錄因子ZEB1（也稱為DEF1）受到β-catenin的直接調(diào)控。在形成EMT的過程中，它不僅在多種不同類型的腫瘤中都可以穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄表達E-鈣粘蛋白（E-cad），還能激活間充質(zhì)基因[28]。根據(jù)研究，經(jīng)典Wnt/β-catenin通路中的各個因子在所有的胰腺癌病例中都上調(diào)，但Wnt/β-catenin信號通路拮抗劑DKK1的上調(diào)卻能促進腫瘤的侵襲，不過其機制尚未明確[29]。Wnt/β-catenin信號通路及其下游基因在胰腺癌中的具體作用還有待更全面的基因檢測以得出進一步的結(jié)論。

3 Wnt/β-catenin信號通路在胰腺癌發(fā)生和發(fā)展中的作用機制

3.1 Wnt/β-catenin信號通路對胰腺癌細胞增殖的作用機制

β-catenin是Wnt通路的調(diào)解中心，胞質(zhì)中的β-catenin與TCF / LEF結(jié)合后進入細胞核成為轉(zhuǎn)錄激活劑，最終激活Wnt靶基因，如C-Myc、細胞周期蛋白D1（CyclinD1）、環(huán)氧合酶-2（COX-2）、c-Jun及纖連蛋白（FN）等。C-Myc是一種常見的原癌基因，可使細胞無限增殖獲永生化功能，是調(diào)控細胞周期的主要基因，與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)。C-Myc表達的變化與細胞的增殖及分化狀態(tài)有關(guān)，其表達產(chǎn)物在調(diào)節(jié)細胞生長、分化或惡性轉(zhuǎn)化中發(fā)揮作用。目前認為胰腺癌、胃癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、宮頸癌等都有C-Myc基因的擴增或過度表達。Cyc1inDl基因又稱PARDI，是Gl期細胞增殖信號的關(guān)鍵蛋白，是細胞周期素之一。CyclinD1能與細胞周期蛋白激酶（CDK4）結(jié)合激活成CDK4一CyclinD1復(fù)合物，與多種蛋白協(xié)同作用促進細胞由G1期向s期的過渡。Schuuring等研究表明Cyclin-D1擴增和蛋白表達在多種組織的癌變早期就已出現(xiàn)，且與腫瘤的浸潤生長、淋巴轉(zhuǎn)移及預(yù)后差有關(guān)。COX-2能激活環(huán)磷酸腺苷（cAMP）途徑誘導(dǎo)腫瘤血管生成，并通過抑制機體免疫系統(tǒng)和改變腫瘤周圍微環(huán)境而利于腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移，其代謝產(chǎn)物前列腺素E2（PGE2）能夠刺激細胞增殖抑制凋亡。另外，COX-2高表達促使慢性炎癥部位形成癌前微環(huán)境（PCM），其具有類似腫瘤微環(huán)境（CM）的生物特性可以促使慢性炎癥向腫瘤轉(zhuǎn)變。

近期有研究發(fā)現(xiàn)一種新型的基因-胰腺癌促進因子（PAUF），能夠通過上調(diào)β-catenin的表達誘導(dǎo)胰腺細胞快速增殖，因此可推測β-catenin可能成為胰腺癌靶向治療的目的基因。激活SIRT1基因能夠在表達PAUF基因的胰腺癌細胞中下調(diào)β-catenin的表達，從而成為胰腺癌的一條治療途徑[30]。

3.2 Wnt/β-catenin信號通路對胰腺癌細胞浸潤遷移的作用機制

Wnt2是循環(huán)腫瘤細胞（CTC）的候選基因，能夠促進胰腺癌細胞的遷移，在人體中胰腺癌非貼壁腫瘤干細胞的形成與多種Wnt基因的上調(diào)有關(guān)。對galectin-3進行轉(zhuǎn)染使β-catenin下調(diào)后，胰腺癌細胞的遷移和侵襲能力都受到抑制[31]。胰腺癌細胞與周圍基質(zhì)環(huán)境之間的相互作用中也出現(xiàn)Wnt信號通路的激活。有研究表明位于上皮組織的E-cad與β-catenin結(jié)合減少的胰腺癌患者往往預(yù)后較差。Krebs yon den Lundgen-6/Mucin 1敲除后，E-cad 和E-cad/β-catenin 復(fù)合體的表達都增加， 但核中的β-catenin， cyclin D1和c-myc的表達都減少，導(dǎo)致胰腺癌細胞的增殖減緩、凋亡增多和侵襲能力下降[32]。定位在細胞膜上的β-catenin受到E-cad的控制以維持細胞與細胞的粘附。在正常成體細胞中，胞質(zhì)內(nèi)的β-catenin大部分與E-cad及α-連環(huán)蛋白（α-catenin）結(jié)合形成復(fù)合體參與細胞骨架的調(diào)節(jié)，維持同型細胞的黏附，保證上皮的完整性，防止細胞轉(zhuǎn)移，少部分游離的β-catenin在胞質(zhì)內(nèi)被降解復(fù)合體磷酸化后由泛素蛋白酶體識別并降解，保持胞內(nèi)β-catenin血低水平狀態(tài)。Wnt通路激活后β-catenin即與E-cad分離，使β-catenin由細胞膜解離而進入胞質(zhì)和胞核，導(dǎo)致E-cad介導(dǎo)的細胞黏附連接作用喪失，使腫瘤細胞脫落、分散和移動，從而形成轉(zhuǎn)移和浸潤。Wnt信號通路的另一個組成部分APC，參與極化細胞的遷移和細胞間的粘附。早期有研究表明，APC定位在遷移細胞上與成束微管相連的細胞膜突出部分。最近有研究發(fā)現(xiàn)APC的分布與以整合素為基礎(chǔ)的定向遷移粘附的信號復(fù)合體的激活相關(guān)。此外還發(fā)現(xiàn)與E-cad和β-catenin相關(guān)的粘合連接點上有一種APC同源體（E-APC），損傷E-APC位點會破壞細胞-細胞間的粘附，上調(diào)胞質(zhì)中β-catenin的水平。Wnt信號通路異常除促進細胞增殖破壞細胞間粘附外還會促進血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）生成 ，同時上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）家族的表達，增加其對細胞外基質(zhì)（ECM）的降解促進腫瘤細胞轉(zhuǎn)移侵襲。CXCR4表達陽性患者的整體生存率顯著低于陰性的患者，CXCR4的缺失會顯著影響胰腺癌細胞的增殖和侵襲，Wnt靶基因如Vimentin and Slug也受到抑制。近期Criscimanna A等[33]發(fā)現(xiàn)缺氧能夠促進胰腺癌的增殖、遷移和侵襲，缺氧誘導(dǎo)因子2α在胰腺上皮內(nèi)瘤變的過程中通過維持Smad4的β-catenin的適當水平調(diào)節(jié)Wnt信號通路。

Dickkopf（DKK）基因蛋白產(chǎn)物是Wnt的拮抗劑，能夠與Frizzled受體結(jié)合參與腫瘤的進展過程。在大部分胰腺癌細胞系中DKK-1的表達顯著上調(diào)，而DKK-3表達水平較低，DKK-2與DKK-4則未檢出。在胰腺癌細胞中敲除DKK-1導(dǎo)致其遷移能力下降，增殖與侵襲的能力也受到抑制。盡管DKK-1對于WNT信號通路起到拮抗作用，它在胰腺癌對周圍組織的浸潤過程中卻起到重要作用?？笵KK1抗體能夠抑制腫瘤細胞的侵襲和增殖能力，能夠作為腫瘤診斷和治療的潛在工具[34]。

4 展望

胰腺癌是一種惡性程度較高的腫瘤，死亡率在所有惡性腫瘤中居第4位。隨著我國生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變，近年來胰腺癌的發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢并且有年輕化的傾向。有研究顯示胰腺癌患者5年生存率不超過5%，伴轉(zhuǎn)移的中位生存時間不超過6個月。胰腺癌預(yù)后極差的原因一方面在于臨床上約80%的胰腺癌患者在出現(xiàn)癥狀而就診時已經(jīng)存在轉(zhuǎn)移，另一方面在于它對于放化療均不敏感，雖然吉西他濱對部分患者能起到一定效果，但還沒有任何一種化療方案能延長轉(zhuǎn)移性胰腺癌患者的生存中位數(shù)，因此開發(fā)新型抗胰腺癌藥物尤為重要。

胰腺癌中Wnt/β-catenin信號通路的激活和調(diào)節(jié)方式意味著臨床上胰腺癌可能更適合基因治療或Wnt/β-catenin信號通路靶向治療，β-catenin也可以作為胰腺癌預(yù)后判斷的生物標志物。最近有研究表明阻斷WNT通路配體和受體的相互作用以調(diào)制Wnt/β-catenin信號通路是一種合適的胰腺癌治療方法。許多人造的Wnt通路調(diào)節(jié)物，包括分子類、多肽類、抗體類，在多種癌癥的動物模型中表現(xiàn)出巨大的前景。實際上Wnt抑制劑OMP-18R5等靶向治療Wnt/β-catenin信號通路的藥物正在逐步發(fā)展到臨床運用中，但只有極少數(shù)的Wnt/β-catenin通路抑制劑進展到臨床試驗早期階段，包括IGC-001、CWP232291、??PRI-72等。除此之外，非甾體類抗炎藥可以降低β-catenin的濃度，抑制Wnt通路。Dihlmann研究證實吲哚美辛和阿司匹林都可干擾β-catenin/TCF復(fù)合物功能來發(fā)揮抑癌作用。甲磺酸伊馬替尼（格列衛(wèi)）可選擇地抑制血小板衍生生長因子（PDGF）受體，下調(diào)Wnt通路關(guān)鍵蛋白β-catenin水平，并能降低Cyclin D1、TCF/LEF等下游靶基因的表達，從而發(fā)揮抗癌的作用。

胰腺癌形成的起始步驟是MAPK/ERK信號通路的激活，是上皮內(nèi)瘤變的關(guān)鍵步驟[35]。突變的Kras和Wnt通路協(xié)同推進其他組織的腫瘤發(fā)生，例如肺和結(jié)腸[36]。近期還發(fā)現(xiàn)黑色素瘤和結(jié)腸癌中都存在MAPK和Wnt通路的上位相互作用[37、38]，在黑色素瘤中Wnt抑制MAPK，而在結(jié)腸癌中Wnt穩(wěn)定Ras從而提高MAPK的活性。大部分腫瘤中存在多通路的共同作用，鑒于Wnt與其他致瘤和抑瘤通路的相互作用，未來的研究不僅要能夠?qū)nt通路抑制劑應(yīng)用到臨床上，還應(yīng)致力于進一步解決Wnt與其余信號通路網(wǎng)絡(luò)之間相互串擾的機制問題。盡管未來充滿挑戰(zhàn)，Wnt/β-catenin信號通路的靶向治療仍是一種很有前景的腫瘤治療方法。

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