王學(xué)治等

摘要：利用改良的CTAB法、SDS法及斑跡抽提法提取三裂葉豚草（Ambrosia trifida L.）不同部位的基因組DNA。結(jié)果表明，改良的CTAB法提取三裂葉豚草韌皮部基因組DNA的提取效果最好。

關(guān)鍵詞：三裂葉豚草（Ambrosia trifida L.）；提?。换蚪MDNA；改良的CTAB法

中圖分類號(hào)：Q943.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）06-1447-03

三裂葉豚草（Ambrosia trifida L.）為菊科（Compositae）豚草屬（Ambrosia）一年生粗壯草本植物，高50～120 cm，有時(shí)可達(dá)170～200 cm，葉掌狀三裂，有時(shí)五裂，幾乎全部對(duì)生[1]。三裂葉豚草原產(chǎn)于北美洲，生命力、競(jìng)爭(zhēng)力極強(qiáng)，傳播途徑多，繁殖系數(shù)大，分布范圍廣，危害大，難以治理，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境已經(jīng)造成了巨大危害[2-4]。2011年，本課題組調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)三裂葉豚草在遼寧、上海、黑龍江、吉林、北京等省市均有分布，并且在形態(tài)上有一定差異。三裂葉豚草分子水平的遺傳變異研究可為探索其傳播規(guī)律與途徑提供一定依據(jù)。

本研究對(duì)三裂葉豚草基因組DNA提取方法及不同部位基因組DNA提取效果進(jìn)行比較研究，為獲取更高質(zhì)量的DNA提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料

三裂葉豚草成熟植株2011年10月采集自沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)科研基地，取其葉片、莖、韌皮部、花序軸置于裝有變色硅膠的密封袋中，干燥保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑

改良的CTAB提取緩沖液[5，6]：50 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），50 mmol/L EDTA，1.6 mol/L

NaCl，2% CTAB；SDS提取緩沖液[7]：50 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），50 mmol/L EDTA，1.4 mol/L NaCl，2% SDS；斑跡抽提緩沖液[8]：10 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），10 mmol/L EDTA，100 mmol/L NaCl，2%SDS，0.039 mol/L二硫蘇糖醇。

1.3 方法

1.3.1 樣品的處理 稱取0.015 g三裂葉豚草干燥葉片，放入研缽中加入石英砂和液氮研磨。將研磨后的粉末轉(zhuǎn)移至2 mL離心管中，分別加入1 mL改良的CATB提取緩沖液和SDS提取緩沖液。斑跡抽提法的樣品處理則不需研磨，直接將樣品放入2 mL離心管中，加入斑跡抽提緩沖液。

1.3.2 基因組DNA的提取 將2 mL離心管放入水浴鍋中65 ℃水浴1 h，斑跡抽提法則需水浴3 h；1 200 r/min常溫離心10 min取上清；加入等體積的酚-氯仿-異戊醇（體積比25∶24∶1）混合液，振蕩混勻后，1 200 r/min常溫離心10 min取上清；加入等體積的氯仿-異戊醇（體積比24∶1）混合液并混勻，1 200 r/min常溫離心10 min取上清，重復(fù)兩次；加入2.5倍體積預(yù)冷的無(wú)水乙醇，-20 ℃放置30 min，1 200 r/min常溫離心10 min留沉淀；加入500 μL 70%乙醇洗滌3次；干燥2 h后加入100 μL TE緩沖液溶解DNA，放置于-20 ℃保存。試驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.3.3 不同組織基因組DNA的提取 采用改良的CATB法分別提取三裂葉豚草的成熟葉片、莖、韌皮部、花序軸等組織部位基因組DNA，提取方法同“1.3.2”。試驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.3.4 基因組DNA樣品質(zhì)量的檢測(cè) 用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)提取樣品的基因組DNA純度，根據(jù)A260 nm/A280 nm判斷DNA純度；通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取樣品的基因組DNA，并用紫外凝膠成像儀觀察并拍照記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取方法提取三裂葉豚草葉片基因DNA的比較

用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)提取樣品的基因組DNA純度，根據(jù)A260 nm/A280 nm來(lái)判定DNA純度。當(dāng)A260 nm/A280 nm接近1.80時(shí)，DNA純度較高，當(dāng)A260 nm/A280 nm<1.80表明有蛋白等雜質(zhì)，A260 nm/A280 nm接近2.00時(shí)表明RNA含量較高，DNA降解較多[9]。改良的CTAB法、SDS法、斑跡抽提法提取三裂葉豚草葉片基因組DNA的A260 nm/A280 nm分別為1.82、1.78和1.96（表1）。結(jié)果表明，改良的CTAB法提取的基因組DNA純度較高；SDS法提取的DNA含有較多蛋白等雜質(zhì)；斑跡抽提法提取的DNA降解嚴(yán)重。在抽提液顏色和DNA顏色上，改良的CTAB法抽提液為綠色，沉淀后的DNA呈白色，表明此方法去除酚類等雜質(zhì)效果很好；而SDS法與斑跡抽提法的抽提液為褐色，沉淀后的DNA均呈深褐色，表明這兩種方法去除酚類等雜質(zhì)效果較弱。通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)（圖1），改良的CTAB法提取的基因組DNA無(wú)明顯拖尾，DNA條帶清晰，效果最好；SDS法提取的基因組DNA點(diǎn)樣孔較亮，DNA有明顯拖尾，表明樣品含有較多蛋白質(zhì)、多糖等雜質(zhì)，提取效果較差；斑跡抽提法提取的基因組DNA無(wú)明顯DNA條帶，DNA幾乎全部降解，效果最差。改良的CTAB法提取的DNA純度高、雜質(zhì)少，是三裂葉豚草基因組DNA的最佳提取方法。

2.2 三裂葉豚草不同組織部位基因組DNA提取結(jié)果的比較

利用改良的CTAB法提取三裂葉豚草成熟葉片、莖、韌皮部、花序軸的基因組DNA，經(jīng)分紫外光光度計(jì)檢測(cè)，A260 nm/A280 nm分別為1.82、1.87、1.86、1.89（表2）。利用此方法提取的不同組織部位基因組DNA質(zhì)量均較好，韌皮部提取純度稍高于其他部位；不同組織部位提取基因組DNA的抽提液顏色及沉淀后的DNA顏色有差異，成熟葉片與花序軸基因組DNA抽提液為深綠色，含酚類等雜質(zhì)較多；莖基因組DNA抽提液顏色為綠色，含酚類等雜質(zhì)相對(duì)較少；韌皮部基因組DNA抽提液顏色最淡，含酚類等雜質(zhì)最少。

對(duì)不同組織部位提取的基因組DNA進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)（圖2）。結(jié)果表明，韌皮部基因組DNA無(wú)明顯拖尾，DNA條帶清晰，韌皮部提取質(zhì)量高雜質(zhì)少；莖和成熟葉片點(diǎn)樣孔較亮，DNA有少量拖尾，莖和成熟葉片含雜質(zhì)相比韌皮部較多，DNA質(zhì)量稍差；花序軸基因組DNA條帶較弱，也有少量拖尾，花序軸提取基因組DNA含量較少，雜質(zhì)較多，質(zhì)量最差。提取三裂葉豚草基因組DNA時(shí)，韌皮部最好，莖和成熟葉片稍差，花序軸效果最差。

3 小結(jié)與討論

3.1 提取方法

本研究對(duì)CTAB法進(jìn)行了改良，高鹽能使DNA和多糖分離，使其較易析出[10]，相比普通CATB法，CTAB緩沖液中NaCl的濃度提高到1.6 mol/L。植物材料中普遍含有多酚類物質(zhì)，容易氧化成棕褐色，與DNA結(jié)合形成不溶物，導(dǎo)致DNA純度下降，不溶物一旦形成就很難去除。酚類化合物在植物材料中存在十分普遍，所以在抽提緩沖液中加入一定量的β-巰基乙醇[11]效果較為明顯，但是過量的β-巰基乙醇能夠使DNA斷裂。經(jīng)過重復(fù)試驗(yàn)，在1 000 μL緩沖液中加入25 μL β-巰基乙醇較為合適。

3.2 提取部位

植物提取基因組DNA的組織取材以幼葉效果最好。但是受限于季節(jié)和野外采樣時(shí)間等因素影響，只能取到成熟葉片，成熟葉片次生代謝物質(zhì)較多，提取到的DNA質(zhì)量差。本研究對(duì)三裂葉豚草的其他組織（莖、韌皮部、花序軸）取樣提取基因組DNA。韌皮部提取到的基因組DNA質(zhì)量最好，莖、成熟葉片次之，花序軸最差。韌皮部提取的DNA沉淀為白色，易溶于TE緩沖液。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)條帶清晰，沒有拖尾降解的現(xiàn)象，適合于代替幼嫩葉片作為基因組DNA提取組織材料。

本研究中采用三裂葉豚草鮮樣提取基因組DNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA條帶很弱或沒有條帶。采用干樣效果較好，可能是鮮樣中酶的活性很高，在提取過程中易使DNA降解，而干樣細(xì)胞中含水較少，使酶的活性降低，甚至部分酶失活，于是研磨時(shí)釋放出的酶對(duì)DNA的影響較小，并且干樣容易在室溫長(zhǎng)期保存，方便在交通不便利的野外取樣運(yùn)輸[12]。

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