趙素霞

【摘 要】目的：觀察光損傷大鼠視網(wǎng)膜腫瘤壞死因子（TNF）-α表達變化的規(guī)律，及預先使用米諾環(huán)素（Minocycline，MC）對其分泌表達的影響，探討視網(wǎng)膜光損傷的損傷機制和防治措施。方法：54只SD大鼠，隨機分為光照對照組、光照實驗組、正常對照組，前兩組再各分為光照后6h、3d、7d、14d組，每組各6只大鼠（12只眼）。光照前90min，光照實驗組大鼠MC灌胃（45mg/kg），光照對照組大鼠等量PBS液灌胃。分別于預定時間點取眼球，左眼石蠟包埋、HE染色、TNF-α免疫組化染色，計算機圖像分析軟件（Image-Pro Plus，IPP）測量視網(wǎng)膜外核層（outer nuclear layer，ONL）厚度。右眼球摘除后即刻完整取出視網(wǎng)膜，勻漿后取上清液，ELISA法測定TNF-α的吸光度（O.D）值并計算出TNF-α濃度。SPSS行統(tǒng)計分析。結果：1，正常對照大鼠視網(wǎng)膜形態(tài)正常，TNF-α未見陽性染色，ELISA定量僅含微量。2，光照對照組視網(wǎng)膜6h即出現(xiàn)病理改變，3d和7d進行性加重，14d略有減輕。視網(wǎng)膜TNF-a陽性表達6h開始增加，3d顯著增加，7d減少，14d進一步減少，ELISA定量結果和免疫組化結果相平行。各時間點ONL厚度、TNF-a表達量和正常對照組相比，P值均<0.05。3，光照實驗組各時間點視網(wǎng)膜病理改變均較光照對照組輕，各時間點ONL厚度兩兩比較P值均<0.05，和正常對照組相比（6h組除外），P值均<0.05，而6h組P>0.05。TNF-a表達量均較光照對照組同一時間點為少，兩兩比較P值均P<0.05，和正常對照組比較（14d組除外）P值均<0.05，14d組P>0.05。結論：本實驗首次研究了光損傷大鼠視網(wǎng)膜TNF-α定位和定量的表達變化，及預先使用米諾環(huán)素對TNF-α表達變化和視網(wǎng)膜病理損傷的影響，結論如下：1.光損傷時過度表達的TNF-α參與并加重了視網(wǎng)膜光損傷。2.MC能減少光損傷大鼠視網(wǎng)膜感光細胞的丟失，對視網(wǎng)膜有保護作用，該作用主要通過抑制TNF-α分泌細胞的活性、減少TNF-α的過度分泌實現(xiàn)。3.分泌TNF-α的小膠質細胞參與了視網(wǎng)膜光損傷的病理生理過程。

【關鍵詞】視網(wǎng)膜光損傷；米諾環(huán)素；免疫組織化學

視網(wǎng)膜光損傷發(fā)病機制和藥物防治的研究是最近幾十年來眼科領域一個基礎結合臨床的重要課題，其中光化學損傷最常見。特別是近年來，各種眼科光學診療器械光源所致視網(wǎng)膜損傷等問題已越來越引起人們的注意，視網(wǎng)膜光化學損傷還是視網(wǎng)膜變性類疾病的良好動物模型，其病理過程與年齡相關性黃斑變性及視網(wǎng)膜色素變性有許多相似之處[1]，而這兩種疾病到目前為止尚無有效的防治方法。所以對視網(wǎng)膜光化學損傷的繼續(xù)深入研究有著重要的理論和臨床實用價值。本實驗意在探討視網(wǎng)膜光損傷的發(fā)病機制，及為其有效防治提供實驗依據(jù)。

1材料和方法

1.1實驗動物及分組 健康雌性SD大鼠54只（8～10周），體重200±20g，檢查無眼疾。隨機分為光照對照組（PBS灌胃）、光照實驗組（MC灌胃）和正常對照組，前兩組再分別分為光照后6h、3d、7d、14d組，每組分別6只大鼠（12只眼）。

1.2光損傷建模 采用自制光損傷裝置（1m×1m×1m）（圖1，圖2）。所有實驗用大鼠（包括正常對照組）均于光照前暗適應24小時。光照前90分鐘，光照實驗組大鼠0.5%MC溶液灌胃（9ml/kg/只），光照對照組大鼠等量PBS溶液灌胃。正常對照組大鼠未予任何處理。用光照強度為1737.9±393.0lux的綠色熒光燈作為致傷光源，連續(xù)照射36小時。光照結束后送回暗環(huán)境飼養(yǎng)。

1.3組織標本的獲取 預定時間點，3%戊巴比妥鈉按1ml/kg腹腔內注射麻醉，迅速摘除雙側眼球（包括球后視神經(jīng)約3mm）。追加3%戊巴比妥鈉過量麻醉處死大鼠。右眼球立即放入盛有PBS液的玻璃皿中，雙目立體顯微鏡下完整取出視網(wǎng)膜并用PBS液再次沖洗，立即稱取濕重后，按重量體積比1：2加入樣品稀釋液，低溫下研磨勻漿視網(wǎng)膜后，移入離心管中，低溫離心機， 10000rpm、4℃下離心20min。收集全部上清液，-20℃?zhèn)溆米鯡LISA檢測。左眼球立即放入4%多聚甲醛溶液中，固定48小時后，去除眼前節(jié)和玻璃體，逐級酒精脫水，常規(guī)石蠟包埋，經(jīng)視乳頭顳側旁1mm縱向做切片。

1.4檢測指標及方法 ⑴視網(wǎng)膜TNF-αELISA檢測；⑵常規(guī)HE染色；⑶TNF-α免疫組化。

1.5結構改變，并測量光照對照組、光照實驗組各時間點和正常對照組ONL厚度，求其均值代表這張圖片ONL的厚度，并以此作為視網(wǎng)膜光感受器最終喪失的判斷指標。各指標以均數(shù)±標準差（X±SD）表示）。光鏡下比較、分析TNF-α免疫組化切片的染色動態(tài)變化及定性、定位變化。用SPSS 15.0 For Windowss進行統(tǒng)計分析。統(tǒng)計方法：各組各時間點的比較用單因素方差分析，光照組和正常對照組之間的兩兩比較及兩組同一時間點比較采用配對t檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1病理改變特點

2.1.1各組視網(wǎng)膜光鏡下組織形態(tài)和ONL厚度的特點（LM×200）：

（1）正常SD大鼠：視網(wǎng)膜形態(tài)正常，結構層次分明，ONL厚度為46.36±3.06μm。（圖3）（2）光照對照組大鼠：光照后6小時即已發(fā)生外層視網(wǎng)膜損傷，3天和7天，外層視網(wǎng)膜損傷進行性加重，7天時，光感受器細胞內外節(jié)可見大的空泡形成，內外節(jié)變短，ONL細胞核進一步減少，、排列紊亂， ONL厚度28.38±2.29μm，較正常減少38.78%（圖4）。14天開始有所修復。

（2）光照實驗組大鼠：光照后6小時僅見外節(jié)結構輕度紊亂，3天和7天，視網(wǎng)膜損傷也呈進行性加重， 但較光照對照同期組視網(wǎng)膜外層損害均明顯為輕。7天時，外節(jié)空泡較前增多增大，內外節(jié)分界欠清晰，內外節(jié)變短，ONL厚度36.04±2.03μm，較正常減少22.26%（圖5）。14天較明顯修復。

2.1.2 光照前后視網(wǎng)膜ONL厚度改變的統(tǒng)計學分析：如表1和圖6示，光照對照組各時間點ONL厚度和正常對照組相比，差別均有統(tǒng)計學意義，P<0.05。光照實驗組除6小時組以外，余各時間點ONL厚度和正常對照組相比，差別均有統(tǒng)計學意義，P<0.05。光照對照組和光照實驗組同一時間點的兩兩比較，差別也均有統(tǒng)計學意義，P<0.05。

2.2 視網(wǎng)膜TNF-α的表達變化

2.2.1 免疫組織化學結果（IHC×200） ⑴正常對照組視網(wǎng)膜全層均未見TNF-α陽性染色（圖7）。⑵光照對照組各時間點視網(wǎng)膜：6h視網(wǎng)膜全層已出現(xiàn)TNF-α棕黃色陽性顆粒，但染色較淺。3d視網(wǎng)膜全層TNF-α棕黃色顆粒強陽性染色達峰值（圖8）。7d和14d視網(wǎng)膜陽性染色進行性消退。⑶光照實驗組各時間點視網(wǎng)膜：6h內層視網(wǎng)膜、外叢狀層（outer plexiform layer，OPL）和ONL內側份出現(xiàn)染色較淺的棕黃色陽性顆粒。3d全層視網(wǎng)膜棕黃色陽性染色達本組峰值，但染色強度明顯較光照對照3d組為弱（圖9）。光照實驗組7d和14d視網(wǎng)膜陽性染色進行性消退，14d時已完全消退。

2.2.2 ELISA定量檢測 將零孔作為對照，畫出標準曲線，從而計算出各樣品的濃度。由于樣品用樣品稀釋液稀釋了2倍，所以其實際濃度×2，得出各組各時間點大鼠視網(wǎng)膜內TNF-α含量如表2和圖10所示。正常視網(wǎng)膜組織僅含微量TNF-α，38.75±7.83 pg/ml。光照對照組光照后6小時視網(wǎng)膜組織內TNF-α開始增多，3天顯著增多，以后逐漸減少，但光照后各觀察時間點和正常對照組相比，差別都有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。光照實驗組光照后視網(wǎng)膜組織內TNF-α表達也呈相似的變化規(guī)律，但各時間點數(shù)值均較光照對照組為低，至14天時已明顯消退，14天組和正常對照組相比，差別無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。光照對照組和光照實驗組各相同時間點兩兩比較，差別都有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

3討論

本實驗利用光照強度1737.9±393.0lux的綠色熒光燈為致傷光源，采用連續(xù)光照36小時的方法，成功制作了SD大鼠的視網(wǎng)膜光化學損傷動物模型。本實驗致傷光源采用波長為510～560nm 的綠光， 這是參考了謝伯林等[2]的光損傷的成功模型。

由于視網(wǎng)膜光損傷主要表現(xiàn)在視細胞，測量視網(wǎng)膜ONL厚度可以比較直觀地反映視細胞損傷的程度，因此本實驗以視網(wǎng)膜ONL厚度為主要觀察指標之一，結合視網(wǎng)膜HE切片光鏡下觀察視網(wǎng)膜組織病理學的改變，來評估視網(wǎng)膜光損傷的程度。實驗中觀察到，光照后各個觀察時間點均出現(xiàn)了視網(wǎng)膜組織的病理改變且呈動態(tài)變化，光鏡下主要為：內外節(jié)結構紊亂，分界不清，ONL細胞核間隙增大，感光細胞核排列不規(guī)則且稀疏，ONL變薄。光照后6h已出現(xiàn)上述病理改變，3d加重，73損傷最重，14天時略有好轉。光照后各個時間點ONL厚度和正常大鼠視網(wǎng)膜ONL厚度相比，差別均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。說明該實驗方法成功制造了SD大鼠的視網(wǎng)膜光損傷，光照后視網(wǎng)膜光損傷進行性加重，7天損傷達峰值，14天時視網(wǎng)膜進入修復期但未能完全恢復正常。這與謝伯林等的研究結果相一致。

MC又稱美滿霉素，為半合成四環(huán)素類廣譜抗生素，通過干擾細菌蛋白的合成而發(fā)揮抗菌作用，但近年多項研究表明，在許多CNS疾病，如腦缺血、腦外傷、多發(fā)性硬化癥、阿爾茨海默病和帕金森病等動物模型上，米諾環(huán)素均發(fā)揮了顯著的神經(jīng)保護作用，即與其抗微生物活性完全不同的抗凋亡活性[3-4]。比如米諾環(huán)素在成年動物的腦缺血損傷模型中顯示了神經(jīng)保護作用，在無論局灶性還是全腦性缺血的模型中，通過米諾環(huán)素全身給藥顯著抑制了小膠質細胞的活性，減輕了炎癥反應，縮小了梗死面積，提示MC的神經(jīng)保護作用和抑制小膠質細胞的過度活化有關。米諾環(huán)素在四環(huán)素類中親脂性最高，全身給藥可通過血腦屏障。而視網(wǎng)膜是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的外延部分，因而我們推斷米諾環(huán)素全身給藥也可通過血視網(wǎng)膜屏障，在視網(wǎng)膜光化學損傷等眼底病變中發(fā)揮神經(jīng)保護作用。米諾環(huán)素口服可迅速、幾近完全吸收，幾乎不受食物的影響，1～2小時即達血藥峰值，血漿半衰期為12～18小時，因此本實驗設計了光照前90分鐘MC灌胃途徑給藥的方法。劑量的選擇（45mg/kg）則基于腦損傷的不同實驗模型中報道的有保護作用的劑量[5]。

實驗中觀察到，MC灌胃組大鼠光照后各觀察時間點也都出現(xiàn)了視網(wǎng)膜組織的損傷變化，但都較PBS灌胃組同一觀察時間點的視網(wǎng)膜損傷為輕，各同一時間點ONL厚度比較，差別都有有統(tǒng)計學意義。而光照實驗組光照后各觀察時間點ONL厚度和正常對照組比較，除14d組外，余各組差別都有統(tǒng)計學意義，14d組和正常對照組相比則無明顯差別（P>0.05）。說明光照前全身預防性應用米諾環(huán)素，視網(wǎng)膜組織損傷輕、恢復快，明顯減少了感光細胞的丟失，對大鼠視網(wǎng)膜光損傷發(fā)揮了有效的神經(jīng)保護作用。這也證明了米諾環(huán)素可以通過血視網(wǎng)膜屏障。

TNF-α是主要由巨噬細胞和活化的單核細胞分泌的前炎性細胞因子，對機體發(fā)揮“雙刃劍”作用，低水平時參與機體的免疫防御，高水平時會給機體造成嚴重損害，在諸多眼病的發(fā)生發(fā)展中起著重要介質作用。本實驗觀察了各組大鼠視網(wǎng)膜中TNF-α的動態(tài)表達變化，取材分別來自同一大鼠的左右眼，采用免疫組織化學定位、定性和ELISA定量觀察相結合的方法。實驗中觀察到，正常對照組大鼠視網(wǎng)膜形態(tài)、結構均未發(fā)現(xiàn)異常，ELISA定量檢測發(fā)現(xiàn)含微量 TNF-α，說明其是視網(wǎng)膜實現(xiàn)正常的生理功能所必需， 對維持視網(wǎng)膜組織的穩(wěn)定狀態(tài)和抵制各種致病因子具有重要意義。光照后6h迅速增多，3d達最大值，為896.65±19.21pg/ml，而HE染色光鏡下觀察視網(wǎng)膜損傷最重是在光照后7d，出現(xiàn)在視網(wǎng)膜TNF-α表達達峰值之后，這提示TNF-α參與并加重了視網(wǎng)膜光損傷。視網(wǎng)膜TNF-α含量7d和14d逐漸減少，但仍維持在一個較高的水平，14d時下降為120.40±9.35pg/ml。上述光照對照組光照后各時間點視網(wǎng)膜TNF-α含量和正常對照組比較，差別均有統(tǒng)計學意義。而光照實驗組光照后各時間點視網(wǎng)膜TNF-α含量也呈相似的動態(tài)變化，但表達量均較相同時間點光照對照組低得多，同一時間點兩兩比較，差別均有統(tǒng)計學意義。說明預防性使用MC明顯抑制了光損傷后視網(wǎng)膜TNF-α的表達。光照后14d，光照實驗組視網(wǎng)膜TNF-α含量已下降到接近正常對照組水平，兩者差別無統(tǒng)計學意義，同時反映視網(wǎng)膜組織損傷程度的ONL厚度也無明顯差別，這就進一步說明TNF-α參與了視網(wǎng)膜光損傷的病理過程，視網(wǎng)膜TNF-α含量和視網(wǎng)膜光損傷程度密切相關，含量的多少直接影響到視網(wǎng)膜損傷程度的大小，當TNF-α含量下降到接近正常水平時，視網(wǎng)膜損傷停止，并以較快的速度完成形態(tài)學的修復。所以筆者認為，視網(wǎng)膜光損傷時TNF-α過度分泌，通過誘導感光細胞的凋亡參與并加重了視網(wǎng)膜光損傷的病理過程。而預防性使用米諾環(huán)素，視網(wǎng)膜損傷減輕而且修復較快，同時TNF-α在視網(wǎng)膜表達明顯減少，看來抑制TNF-α的過度分泌是米諾環(huán)素發(fā)揮神經(jīng)保護作用的重要機制之一。

TNF-α主要來自單核巨噬細胞系統(tǒng)，而CNS和視網(wǎng)膜中固有的巨噬細胞是神經(jīng)膠質細胞中的小膠質細胞[6]，故CNS和視網(wǎng)膜病理損傷時表達增加的TNF-α主要由小膠質細胞分泌， TNF-α被稱為“小膠質細胞源性毒性細胞因子”之一。已有多項研究發(fā)現(xiàn)，米諾環(huán)素是中樞神經(jīng)系統(tǒng)小膠質細胞的抑制劑[7]，但尚未發(fā)現(xiàn)對其他細胞有抑制作用。所以本實驗條件下，小膠質細胞是光損傷后視網(wǎng)膜TNF-α的主要分泌細胞。視網(wǎng)膜光損傷中米諾環(huán)素通過抑制小膠質細胞的過度活化，減少了TNF-α的過多分泌表達，從而發(fā)揮了抗凋亡活性。米諾環(huán)素還有無其他可能發(fā)揮保護作用的機制還有待進一步的研究。

參考文獻：

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